[发明专利]一种脱细胞气管支架的制备方法

权利要求书

1.一种脱细胞气管支架制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取哺乳动物的气管并进行预处理；

(2)采用用于动物气管脱细胞处理的试剂对气管进行脱细胞处理；

所述试剂，包括消化液A、消化液B、消化液C和消化液D；

所述消化液A为含有胰酶的EDTA消化液，且所述消化液A中胰酶的质量百分比为0.25％；

所述消化液B为含有NaCl的Tris-HCl缓冲液，所述消化液B的pH＝8.0，所述消化液B中Tris的浓度为0.05M，NaCl浓度为87.7g/L；

所述消化液C为含有TritonX-100的Tris-HCl缓冲液，所述消化液C的pH＝7.4，所述消化液C中Tris的浓度为0.05M，TritonX-100的浓度为10mL/L；

所述消化液D为含有DNAseI、RNAseI、MgCl₂、CaCl₂的Tris-HCl缓冲液，所述消化液D的pH＝7.6，所述消化液D中Tris的浓度为0.01M，DNAseI的浓度为2mg/L，RNAseI为2mg/L，MgCl₂的浓度为1.22g/L，CaCl₂浓度为1.11g/L；

步骤(2)中，采用无菌D-Hanks液对气管进行震荡洗涤后，再进行脱细胞处理，脱细胞处理具体包括以下步骤：

(2.1)在气管中加入消化液A，在4℃震荡12-24小时，转速100-200转/分钟，每4-8小时换液一次；

(2.2)去除消化液A，加入消化液B，在4℃震荡24小时，转速100-200转/分钟，每4-8小时换液一次；

(2.3)去除消化液B，加入含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液，在4℃震荡洗涤3-5次，每次5-20分钟，转速100-200转/分钟；

(2.4)去除D-Hanks液，加入消化液C，4℃恒温摇床震荡12-24小时，转速100-200转/分钟，每4-8小时换液一次；

(2.5)去除消化液C，加入含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液，在4℃震荡洗涤3-5次，每次5-20分钟，转速100-200转/分钟；

(2.6)去除D-Hanks液，加入消化液D，在37℃震荡4-10小时，转速100-200转/分钟，每2-6小时换液一次；

(2.7)去除消化液D，加入消化液C，在4℃震荡12-24小时，转速100-200转/分钟，每4-10小时换液一次；

(2.8)去除消化液C，加入D-Hanks液，在4℃震荡洗涤3-5次，每次5-20分钟，转速100-200转/分钟，然后去液加入75％酒精常温下消毒0.5-1小时；

(2.9)去除酒精，加入D-Hanks液，在4℃震荡洗涤12-48小时，转速100-200转/分钟；每4-10小时换液一次，将气管在4℃D-Hanks液保存备用。

2.根据权利要求1所述的脱细胞气管支架制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将新西兰大白兔处死后，采用75％的乙醇消毒头、颈和胸部，依次分离皮肤、筋膜和肌肉，充分暴露气管，沿环状软骨下0.5-1cm处横向切断气管1-4cm，放入含有PBS缓冲液的培养皿中，去除气管表面异物，采用青霉素和链霉素双抗浸泡5-10min，75％酒精消毒0.5-1小时，放入含青霉素和链霉素双抗的冷D-Hanks缓冲液，在4℃摇床震荡冲洗3-5次，摇床转速100-200转/分钟，每次5-20分钟，冲洗后放入含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液，在4℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的脱细胞气管支架制备方法，其特征在于，步骤(2.1)中的消化液A、步骤(2.2)中的消化液B、步骤(2.4)中的消化液C、步骤(2.6)中的消化液D和步骤(2.7)中的消化液C的体积用量比为1:1:1:1:1。

4.根据权利要求1所述的脱细胞气管支架制备方法，其特征在于，步骤(2.1)中的消化液A、步骤(2.2)中的消化液B、步骤(2.3)中的含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液、步骤(2.4)中的消化液C、步骤(2.5)中的含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液、步骤(2.6)中的消化液D、步骤(2.7)中的消化液C、步骤(2.8)中的D-Hanks液和步骤(2.9)中的D-Hanks液的体积用量比为1:1:1:1:1:1:1:1:1。