[发明专利]mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法、抗-反向帽类似物及应用在审

专利信息
申请号: 202011415202.4 申请日: 2020-12-03
公开(公告)号: CN112521437A 公开(公告)日: 2021-03-19
发明(设计)人: 苏晓晔;李爽;雷奕欣;朱雅婧;彭育才 申请(专利权)人: 珠海丽凡达生物技术有限公司
主分类号: C07H21/02 分类号: C07H21/02;C07H1/06;C12N15/10
代理公司: 北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙) 11463 代理人: 张金铭
地址: 519000 广东省珠海市横琴新区环岛东*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: mrna 体外 转录 过程 反向 类似物 回收 方法 应用
【说明书】:

发明提供了一种mRNA体外转录过程中抗‑反向帽类似物的回收方法、抗‑反向帽类似物及应用,涉及生物技术领域,本发明提供的mRNA体外转录过程中抗‑反向帽类似物的回收方法,适用于任何类型mRNA的体外转录过程,该回收方法通过高效液相色谱法初步分离mRNA转录反应后的反应液中的抗‑反向帽类似物,再将初步分离得到的抗‑反向帽类似物粗品依次经纯化、浓缩和干燥后,即可得到抗‑反向帽类似物,实现对抗‑反向帽类似物的重复利用。该回收方法有效降低了mRNA生产的成本,提高了原料的利用效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法、抗-反向帽类似物及应用。

背景技术

信使RNA(mRNA)药物是一种极具潜力的新治疗方案,在免疫学、肿瘤学和疫苗等领域都有广泛前景。mRNA包含着细胞制造蛋白质并将其送到身体各个部位的指令,因此mRNA作为药物使用可指导细胞内蛋白质表达或者细胞外蛋白分泌。有效的mRNA疗法需要将mRNA有效递送至患者以及在患者体内有效生成由该mRNA编码的蛋白。

mRNA原液产品的基本结构至少包括:5‘帽子结构以及具体编码蛋白质的mRNA序列(图1)。其中,mRNA的5‘帽子结构尤为关键。细胞内的核糖体通过mRNA的5‘帽子结构将mRNA的序列翻译成蛋白质。且帽子能够使mRNA更稳定不致被外切核酸酶降解,不带帽子的mRNA无法正常编码蛋白。因此生产mRNA产品的过程中,确保mRNA带有5’帽子结构的加帽反应尤为重要。

mRNA原液的生产是通过体外酶催化反应进行的。具体为在反应中,T7 RNA转录酶以线性化的DNA质粒为模板,以抗-反向帽类似物(ARCA:Anti Reverse Cap Analog)为例,和核苷三磷酸混合物NTPs(包括腺苷三磷酸ATP,尿苷三磷酸UTP,胞苷三磷酸CTP和鸟苷三磷酸GTP)为原料,通过转录反应完成(图2)。其中,帽子结构为图示中蓝色标记。mRNA的加帽是在DNA转录mRNA的反应过程中,通过ARCA抗-反向帽类似物(帽子)和NTPs同时反应完成的,将该生产过程称为共转录反应。

通过反应过程可以发现,由于抗-反向帽类似物和鸟苷三磷酸(GTP)在化学结构上的相似性,且T7 RNA转录酶对二者的反应活性相同,因此共转录反应会产生一定比例的不加帽产物。该产物为无效杂质,在mRNA药物生产过程中应该尽量避免。

为了提高反应产物的加帽比例,在实际生产过程中,通过提高ARCA的用量(ARCA:GTP=4:1)来保障~80%左右的加帽效率。对于一般的含有数百个到数千个碱基的mRNA产品来说,由于合成后的mRNA中仅含有一个帽子结构(由抗-反向帽类似物产生)和数百上千个碱基(由NTPs原料产生),因此转录反应对反应起始原料中的抗-反向帽类似物的利用率可能仅有其他NTPs原料利用率的数千分之一。再加上抗-反向帽类似物的原料成本远超其他反应原料,因此开发该抗-反向帽类似物化合物的循环利用技术具有巨大的产业化意义。

有鉴于此,特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法,以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供采用上述回收方法回收得到的抗-反向帽类似物。

本发明的第三个目的在于提供上述回收得到的抗-反向帽类似物在mRNA体外转录中的应用。

本发明提供了一种mRNA体外转录过程中抗-反向帽类似物的回收方法,通过高效液相色谱法分离mRNA转录反应后的反应液中的抗-反向帽类似物,得到抗-反向帽类似物粗品,将抗-反向帽类似物粗品依次经纯化、浓缩和干燥后,得到抗-反向帽类似物。

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