[发明专利]一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒及其应用方法

说明书

本发明公开了一种检测人Circ‑E‑cad蛋白的ELISA试剂盒，具体工作液配置如下：标准品液6瓶(1ml/瓶)，酶标记物7ml，抗体工作液7ml，底物A液7ml，底物B液7ml，终止液7ml，20X浓缩洗涤液40ml，样本稀释液50ml，抗原包被的酶标板。本发明还公开了该试剂盒的应用方法。本发明通过制备特异性检测Circ‑E‑cad蛋白的小鼠来源的单克隆抗体开发了检测人Circ‑E‑cad蛋白的ELISA试剂盒，试剂盒提供目标分子检测的所有工作液，可用于对人临床样品中Circ‑E‑cad蛋白的定量检测，试剂盒具有特异性强、重复性好、灵敏度高的特点，可快速实现样品中目标蛋白的定量检测。

技术领域

本发明涉及一种ELISA试剂盒及其应用方法，属于分子生物学蛋白检测领域，特别涉及一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒及其应用方法。

背景技术

自2012年以来，在生物体内陆续发现了大量存在的环状的RNA(circula RNA，circRNA)，生物体内的环状RNA是一类具有特殊功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成。以前的研究由于技术水平的限制，没有发现这部分环状RNA的客观存在，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。

对于环状RNA的具体功能和作用分子机制的研究报道较少，目前只有几种假定的说法：环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能；环状RNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；环状RNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性，环状RNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。

前期工作中，通过核糖体印迹与深度测序技术(Ribosome Profiling and DeepSequencing)结合生物信息学分析，发现了一批在恶性胶质瘤中差异表达并且具有潜在翻译能力的环状RNA候选分子。结合环状RNA数据库Circbase进一步的分析发现，环状RNACirc-E-cad-733nt在肿瘤和配对的瘤旁正常脑组织中差异表达最明显，Circ-E-cad-733nt在瘤旁正常脑组织中表达非常微弱或不表达，只在恶性胶质瘤组织中特异性高表达，通过制备抗体及蛋白质谱鉴定Circ-E-cad-733nt翻译了一个由254个氨基酸组成的新的蛋白质Circ-E-cad。在肿瘤研究及临床检测中，聚焦新发现的蛋白，能进一步加深我们肿瘤发生发展的理解，针对这些新的蛋白分子靶点设计新的检测方法，具有潜在的临床应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒及应用方法，通过制备特异性检测Circ-E-cad蛋白的小鼠来源的单克隆抗体开发了检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，可用于对人临床样品中Circ-E-cad蛋白的定量检测。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种检测人Circ-E-cad蛋白的ELISA试剂盒，具体工作液配置如下：

(1)标准品液6瓶(1ml/瓶)，用制备单克隆抗体的多肽偶联人血清白蛋白BSA分子作为标准品，配置的样品稀释液为含0.05％吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐溶液，最终用酸碱调节PH为7.0；取标准品，然后用样品稀释液配置梯度浓度的标准品0μg/ml、2μg/ml、6μg/ml、18μg/ml、54μg/ml、162μg/ml；

(2)酶标记物7ml：本试剂盒中用到的酶标记物为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG免疫球蛋白，用0.01M浓度的PBS将IgG配置成最浓度为4μg/ml，作为本试剂盒中的酶标记物；