[发明专利]一种参与抗旱的苹果自噬相关基因及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种参与抗旱的苹果自噬相关基因及其应用，所述基因为MdATG5a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可以通过苹果自噬抗旱基因构建强抗旱的转基因植株，从而提高植株抗旱性。本发明的苹果自噬抗旱基因MdATG5a，能够用于构建强抗旱的转基因植株，提高转基因植物的自噬活性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种参与抗旱的苹果自噬相关基因及其应用。

背景技术

自噬是指当细胞处于逆境或特殊生长发育阶段时，细胞降解老化受损蛋白或细胞器并将降解产物回收利用的过程，其在真核生物的进化中高度保守。植物细胞自噬主要有三种类型，包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬(Bassham,2009)。其中巨自噬是通常意义上所指的细胞自噬，也是研究最广泛且最为深入的自噬类型。胞质成分或细胞器等待降解物被包裹进入双层膜结构形成自噬体，双层膜自噬体的形成是自噬过程发生的显著标志。形成自噬体的外膜能够与液泡膜或溶酶体膜融合，进而包裹货物的内膜结构被运送至液泡或溶酶体的酸性环境中进行降解，其降解产物可释放至胞质并循环利用(Liu andBassham,2012)。

自噬概念于1963年被首次提出，而后Ohsumi等于1993年在酵母中分离出了第一批自噬相关基因(Tsukada and Ohsumi,1993)。截至目前，研究人员已于酵母中鉴定出三十多个自噬相关基因。通过同源克隆的方式，动植物中的自噬相关基因相继被克隆鉴定出来。这些自噬基因参与到自噬发生过程的每一个阶段，包括自噬的诱导、自噬泡的成核与延伸扩张、自噬泡的成熟以及其与溶酶体或液泡融合等过程(Klionsky et al.,2003；Nakatogawaet al.,2009；Feng et al.,2014)。根据参与自噬发生阶段的不同，可将自噬蛋白分成以下四类：ATG1激酶复合体、ATG2/9/18跨膜复合体、磷脂酰肌醇3-激酶复合体以及ATG8-PE和ATG5-12-16两个类泛素蛋白结合系统。其中，ATG8-PE和ATG5-12-16蛋白复合体在自噬体膜的延伸扩张以及最终包裹待降解物形成自噬体的过程中发挥着重要作用。自噬蛋白ATG5所参与的ATG5-12-16类泛素结合系统作用于自噬体膜的弯曲并募集自噬蛋白ATG8，促进ATG8与PE的结合。因此，ATG5是自噬发生过程中最为关键的蛋白之一，拟南芥自噬缺陷突变体atg5-1无法形成自噬小体，且对多种逆境胁迫高度敏感(Le Bars et al.,2014)。

随着自噬研究的深入，检测自噬发生水平的方法也趋于成熟，主要手段包括以下三种：透射电镜检测法(TEM)、自噬体膜标志性蛋白质ATG8检测法和单丹(磺)酰戊二胺染色法(MDC)染色法。上世纪九十年代，自噬最初被检测到所用的方法就是TEM方法。透射电镜检测自噬体不仅能够清晰观察到自噬体的形态，还可通过所观测到自噬体的大小与数量推测自噬活性强弱。ATG8是自噬体膜标志蛋白，其与PE共价结合由水溶形式转变为脂溶形式，脂溶性的ATG8结合于自噬体膜上直至自噬体降解，因此ATG8常被作为指示自噬发生强度的衡量标准(Tanida et al.,2004)。MDC是自噬囊泡示踪剂，能够与自噬体结合，经MDC染色后可通过流式细胞仪或荧光显微镜检测到含有自噬泡的细胞(卢建美等，2012)。便捷成熟的自噬体检测方法为我们的研究奠定了基础。