[发明专利]一种污染物中氨氧化细菌的定量方法

说明书

本发明属于污水检测技术领域，涉及一种污染物中氨氧化细菌的定量方法。包括以下步骤：i)构建含有氨氧化细菌的DNA片段的质粒；ii)将质粒导入感受态细胞中，并进行扩繁、质粒提取、梯度稀释，获得不同浓度的质粒；iii)从污染物中提取DNA；iv)对不同浓度的质粒和步骤iii)获得的DNA进行荧光定量PCR，得到不同浓度的质粒分别对应的荧光强度和DNA对应的荧光强度；v)根据不同浓度的质粒以及每个浓度的质粒对应的荧光强度，绘制标准曲线；vi)根据标准曲线和样品DNA对应的荧光强度，计算所述污染物中氨氧化细菌的含量。本发明提供的检测氨氧化细菌的方法具有重复性好、特异性强、灵敏度高、操作过程简便等优点，大幅度提高了检测效率。

技术领域

本发明属于污水检测技术领域，具体地，涉及一种污染物中氨氧化细菌的定量方法。

背景技术

氨氧化细菌(AOB)是城市污水处理厂生物脱氮过程中起作用的主要细菌之一，主要将NH₄⁺氧化为NO₂^-，氨氧化细菌是一类自养型代谢细菌，生长缓慢，与异养菌在溶解氧和空间的竞争中处于劣势，对污水中的有毒物质，以及有机负荷、pH、温度、DO等参数冲击敏感，是影响硝化过程稳定性的主要微生物，氨氧化过程被认为是脱氮过程的关键步骤。

因此，准确检测厌氧氨氧化菌的含量，对于污水处理工艺优化控制和稳定运行具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种污染物中氨氧化细菌的定量方法，可准确检测污染物中氨氧化细菌的含量。

发明人在研究中发现，微生物转化过程是通过酶催化反应实现的，参与氨氧化过程的关键酶是氨单加氧酶(AMO)和羟氨氧化酶(HAO)，氨单加氧酶(AMO)由AmoA、AmoB和AmoC三个亚基组成，这三个亚基分别由amoA、amoB和amoC三个基因所编码，amoA基因是AOB所特有的结构性基因，amoA基因为研究氨氧化细菌的重要分子标记物。

基于此，本发明提供一种污染物中氨氧化细菌的定量方法，该方法包括以下步骤：

i)构建含有氨氧化细菌的DNA片段的质粒；

ii)将所述质粒导入感受态细胞中，并对所述感受态细胞进行扩繁，提取扩繁后的感受态细胞中的质粒，对该质粒进行梯度稀释，获得不同浓度的质粒；

iii)从污染物中提取DNA，提取的DNA包含氨氧化细菌的DNA；

iv)对步骤ii)获得的不同浓度的质粒和步骤iii)获得的DNA进行荧光定量PCR，得到步骤ii)获得的不同浓度的质粒分别对应的荧光强度和步骤iii)获得的DNA对应的荧光强度；

v)根据步骤iv)得到的不同浓度的质粒以及每个浓度的质粒对应的荧光强度，绘制标准曲线；

vi)根据所述标准曲线和样品DNA对应的荧光强度，计算所述污染物中氨氧化细菌的含量。

具体地，步骤ⅰ)包括以下步骤：

a)获取含有氨氧化细菌的样品；

b)提取所述含有氨氧化细菌样品的DNA，之后进行PCR，获得氨氧化细菌的DNA片段，即PCR产物；

c)将PCR产物进行切胶回收；

d)将所述回收后DNA片段导入载体中，构建含有氨氧化细菌的DNA片段的质粒。