[发明专利]血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20及其构建方法和应用

权利要求书

1.血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通过将我国FAdV-4新近分离株HLJFAd15的Hexon基因替换为国外禽腺病毒弱毒株ON1的Hexon基因，然后通过病毒拯救后获得的。

2.如权利要求1所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，其特征在于，所述的FAdV-4新近分离株HLJFAd15的全基因组GenBank序列号为KU991797。

3.如权利要求1所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，其特征在于，所述的国外禽腺病毒弱毒株ON1的NCBI登录号为GU188428。

4.如权利要求1所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，其特征在于，国外禽腺病毒弱毒株ON1的Hexon基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求1-4任一项所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，其特征在于，所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株是通过以下方法构建得到的：

(1)含有HLJFAd15毒株完整基因组的粘粒的构建

获得FAdV-4新近分离株HLJFAd15毒株的全基因序列，HLJFAd15的全基因组GenBank序列号为KU991797，连接至pCC1Fos载体，经噬菌体包装后电转进EPI300感受态细胞中，涂布在氯霉素抗性LB平板上，挑取阳性克隆，经ZR BAC DNA miniprep Kit提取粘粒后，使用载体通用引物测序，得到含有HLJFAd15毒株完整基因组的粘粒，命名为Fos-rFAdV4；

(2)rHN20感染性克隆粘粒的构建

使用Counter-Selection BAC Modification Kit构建rHN20感染性克隆粘粒，方法如下：首先将步骤(1)构建得到的Fos-rFAdV4电转进DH10B感受态细胞中，通过氯霉素抗生素筛选阳性克隆；然后再将Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的重组酶质粒pRed E/T电转进含Fos-rFAdV4的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素和链霉素筛选阳性克隆；以Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的rpsl-neo表达盒DNA为模板，使用引物rHN-rpslneo F和rHN-rpslneo R扩增带有需替换Hexon基因片段两端各50bp同源臂的rpsl-neo表达盒，将回收的PCR产物直接转化进入经L-阿拉伯糖诱导的含有Fos-rFAdV4和pRed E/T的DH10B感受态细胞中，即可替换原始Hexon基因，通过氯霉素、链霉素和卡那霉素抗生素筛选阳性克隆，得到Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo；再以相同方式，以puc57-HN质粒为模板，所述的puc57-HN质粒为ON1毒株Hexon基因克隆到puc57中得到，使用引物rHN F和rHN R扩增ON1毒株的Hexon基因，将PCR产物电转进上一步阳性克隆制备的经L-阿拉伯糖诱导的含Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo的DH10B感受态中，通过链霉素和氯霉素抗生素筛选得到将HLJFAd15的Hexon基因替换为国外禽腺病毒弱毒株ON1的Hexon基因的阳性克隆，命名为Fos-rHN20；引物序列如下：

rHN-rpslneo F：cacggcttacaacccgctggctcccaaggagtccatgtttaacaactggtGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG

rHN-rpslneo R：gtgtcgaacacgccatagagcatgtacacgtaagtgggatcatccatgggTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG

rHN F：cacggcttacaacccgctggctcc

rHN R：gtgtcgaacacgccatagagcatg

(3)病毒拯救

用QIAGEN质粒中提试剂盒提取Fos-rHN20粘粒，用FseI限制性内切酶进行线性化，通过醇沉回收DNA，将LMH细胞接种至6孔板，用转染试剂X-tremeGene HP DNA TransfectionReagent Kit转染线性化的Fos-rHN20，转染后6h更换新鲜培养基，5d后将6孔板放入-80℃冰箱反复冻融3次，离心，收集上清，即为拯救所获的rHN20重组毒。