[发明专利]一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker双链设计方法

说明书

本发明公开了一种ARMS‑TaqMan Blocker体系的Blocker双链设计方法，将Blocker设计在互补链上，形成非竞争性Blocker，与竞争性Blocker同时使用；非竞争性Blocker设计原则：将Blocker设计在突变位点处，覆盖突变位点；Blocker与野生型模板完全匹配；Blocker与突变型模板不完全匹配，不完全匹配的Tm值与退火温度一致或接近；Blocker的3’末端添加多个与模板不匹配的无关碱基。本发明创造性提出非竞争性Blocker设计原则，与竞争性Blocker同时使用，形成双链压制体系，可针对初期产生的少量非特异产物进行压制，在保证体系灵敏度不受影响的前提下，大大提高体系的特异性。

技术领域

本发明涉及肿瘤突变检测技术领域，具体是一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Bloc ker双链设计方法。

背景技术

近年来，探针的非放射性标记受到广泛重视，同时得到迅速发展，广泛应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断等。ARMS技术是常用的荧光探针法，其基本原理是，如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。有时候为了提高特异性，会在体系中加入野生型模板扩增阻断剂(Blocker)，用以压制野生型模板的扩增，虽然这种方法在一定程度上可以压制野生，但是由于缺乏准确的Blocker设计软件和有效的筛选规则，导致压制效果不理想；另外，也可在ARMS引物的3’端倒数第二或第三个碱基处引入错配碱基，但是引入错配碱基通常会牺牲灵敏度。因此，常规ARMS-TaqMan Blocker体系一般很难同时做到灵敏度、特异性兼顾，常需要复杂繁琐的优化工作。

传统的竞争性Blocker设计在与ARMS引物部分交叠的位置，起到竞争性作用，但仅能对非特异模板的单链进行压制，如果ARMS引物的特异性不理想，初期产生的少量非特异产物会成为后续扩增的模板，并且逃离Blocker的压制作用，增加了非特异信号。

传统的竞争性Blocker设计原则为：①将Blocker设计在突变位点处，覆盖突变位点，与ARMS引物部分重叠，起到位置竞争作用，且尽量使突变位点位于Blocker的中间位置，使得Blocker熔点差较大(依据：突变位点位于中间时的熔点差大于突变位点位于两边时的熔点差)；②Blocker与野生型模板完全匹配，Tm值比ARMS引物与野生型模板匹配的Tm值高约5℃，使Blocker与野生型模板优先结合，而且有时为了增大熔点差，会加入LNA、MGB等修饰；③Blocker与突变型模板不完全匹配，Tm值比ARMS引物与突变型模板匹配的Tm值低，使ARMS引物与突变型模板优先结合；④Blocker的3’末端需加上封闭修饰，如硫代修饰、氨基修饰、磷酸化修饰等，以防止延伸。

发明内容

针对现有ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker设计存在的技术缺陷，本发明提供一种非竞争性Blocker设计，与竞争性Blocker设计同时使用，形成双链压制的ARMS-TaqMan Blocker体系。

本发明保护一种ARMS-TaqMan Blocker体系的双链Blocker设计方法，将Blocker设计在互补链上，形成非竞争性Blocker，与竞争性Blocker同时使用。

非竞争性Blocker设计原则：将Blocker设计在突变位点处，覆盖突变位点；Blocker与野生型模板完全匹配；Blocker与突变型模板不完全匹配，不完全匹配的Tm值与退火温度一致或接近；Blocker的3’末端添加多个与模板不匹配的无关碱基。