[发明专利]一种新型冷冻保护液

说明书

本发明公开了一种新型冷冻保护液，包含：蛋黄200mL/L、柠檬酸钠13.536g/L、三羟甲基氨基甲烷24.224g/L、葡萄糖11g/L、硫酸链霉素100万单位1g/L、青霉素160万单位0.8g/L、甘油30mL/L、海藻糖0.05moL/L‑0.15moL/L。本冷冻保护液降低保护液毒性，提高冻融效果；在冷冻精子时能够显著改善精子的活力、质膜完整性、顶体完整性、酪氨酸磷酸化水平和鱼精蛋白缺乏水平、活率与线粒体膜电位，提高冻融后精子质量。

技术领域

本发明涉及冷冻保存技术领域，具体涉及一种新型冷冻保护液。

背景技术

延边黄牛品种特征和肉品特性优良，具有鲜明的地域特色，是中国五大地方良种牛之一。冷冻保存对精子功能和生育能力的影响已经得到了广泛的研究，特别是在牛身上。精子的冷冻保存是保存哺乳动物精子的一种有效途径。该方法常常被用作培育优良后代，牲畜的生产潜力，以及辅助治疗因生育能力损伤而采取的人工授精等。所以对于遗传与育种方面，精子的冷冻保存是十分重要的方法。从雄性生殖器中取出活力良好的精子，经过对冷冻过程中的处理用来促进物种之间的遗传改良。精液冷冻保存中最重要的挑战是其对冷冻保存方法的内在敏感性，这种方法极大地改变了精子顶体完整性，质膜的流动性和渗透性以及DNA的完整性，并导致mRNA和蛋白质降解，严重损害精子的功能，降低存活率，产生毒性作用，从而影响生殖能力。所以探索最合适的浓度非常重要。

在冷冻保存过程中，甘油作为渗透性保护剂阻止了冰晶对精子膜的破坏作用，从而精子的活力、顶体膜完整性和质膜完整性等质量参数均有一定的改善。但是甘油的毒性会造成精子鱼精蛋白的缺失，造成受精率降低。

甘油通过渗透性来刺激细胞脱水到细胞外的作用，从而减少了可用于冷冻的细胞内水的体积。它的作用机理与其在低温下降低电解质浓度和渗透收缩程度的能力有关。具体而言，通过插入脂质双层中影响细胞质粘度，改变扩散速率并改变细胞膜特性。在高于5℃的温度下会引起渗透体积变化，更有可能会损坏细胞。因此，它们需要在冻结之前渗透，并且在解冻时必须迅速移除。但甘油也有不利影响，对精子是具有一定的毒性的。已经表明，甘油的摩尔浓度可以影响细胞质的物理特征(细胞质组织和粘度)，双层膜的渗透性和稳定性，以及蛋白质与膜的非共价键结合。在1992年Hammerstedt和Graham探讨家禽精子冷冻的问题时，阐述了甘油对精子的作用，这包括减弱了精子的受精能力。

许多实验结果证实海藻糖可被用作冷冻保护剂，因为海藻糖有助于细胞脱水，冷冻保存过程中产生横跨精子膜以减少水流和防止冰晶生产。并且海藻糖与精子膜磷脂和蛋白质相互作用并对其进行了修饰，从而改善了膜的柔韧性，进一步抵抗冷冻损伤。因为海藻糖无法扩散穿过质膜，从而产生渗透压，引起细胞脱水并使得细胞内冰晶形成的发生率降低。它与质膜中的磷脂相互作用，从而提高了精子的冷冻保存率。近些年来，在公羊和山羊精液的冷冻保护剂中添加高浓度的海藻糖可以较好的保护解冻后的运动参数，恢复率，耐热性和顶体完整性。

精子的冷冻保存可以延长其在体外的寿命，但是由于冷冻解冻过程中精子的结构和生理功能的改变，使得精子出现损伤，进而大大降低了其受孕率。为了减少在冷冻解冻过程中对精子的损伤程度，对冷冻保护剂的研究与完善是尤为重要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型冷冻保护液，其以海藻糖替代原始保护液中的部分甘油，降低保护液中甘油产生的毒性，提高冻融效果。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种新型冷冻保护液，其特征在于，包含：蛋黄200mL/L、柠檬酸钠13.536g/L、三羟甲基氨基甲烷24.224g/L、葡萄糖11g/L、硫酸链霉素100万单位1g/L、青霉素160万单位0.8g/L、甘油30mL/L、海藻糖0.05moL/L-0.15moL/L。

本发明的有益效果在于：降低保护液毒性，提高冻融效果；在冷冻精子时能够显著改善精子的活力、质膜完整性、顶体完整性、酪氨酸磷酸化水平和鱼精蛋白缺乏水平、活率与线粒体膜电位，提高冻融后精子质量。