[发明专利]一株产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株及其应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株及其液体发酵技术。本发明中所述的高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)FSM‑208063，该菌株已于2020年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20724。是由一株黑曲霉经亚硝基胍诱变选育获得。由该菌株生产的酸性蛋白酶在80℃保温4h后剩余酶活在70％以上，具有良好的耐酸性和耐热性，可应用于酿酒、食品、饲料以及皮革加工等行业。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株产酸性蛋白酶的黑曲霉突变菌株及其应用。

背景技术：

酸性蛋白酶是一种能在pH值为2.5～5.0环境下水解蛋白质的酶类。酸性蛋白酶对pH值的这种要求，可能与其酶活中心含有的羧基有关。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。

目前商品化的酸性蛋白酶大都来源于微生物，可产酸性蛋白酶的微生物菌株有：斋藤曲霉，泡盛酒曲霉，微小毛霉，青霉，根霉，宇佐美曲霉、黑曲霉、米曲霉、拟青霉、啤酒酵母、乳酸杆菌、枯草杆菌等。其中商品化的酸性蛋白酶生产菌主要是米曲霉，黑曲霉、宇佐美曲霉。

专利CN 201810409771.4公布了一种改变传统的曲盘结构和液体发酵工艺，采用固体发酵方式来提高酶活力的方法，发酵物料的酶活力达62314.0U/g。

专利CN201510677600.6本发明公布了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉诱变株及其液体发酵方法，所述黑曲霉突变菌株为黑曲霉TP-235，该菌株通过液体深层发酵在50L发酵罐上经补料发酵培养100-120h，产酶水平为21852U/mL。生产的酸性蛋白酶最适pH范围为2.5-3.5，最适作用温度范围为55℃-65℃，在60℃保温1h后剩余酶活为78％，80℃保温2h后剩余酶活为58.4％。

专利CN201810014018.5公布了一种酸性蛋白酶及其编码基因和应用，该蛋白酶的最适pH为3.5，在pH 2.5-pH 3.5范围内，该酶能够维持其70％以上的酶活力；最适温度60℃，在65℃时依然具有60％以上的酶活力。

但是由于受原材料价格上涨及国外同行业中酶活水平的不断提高，目前国内现有技术中酸性蛋白酶的发酵水平普遍较低，产品的竞争力不足，所以选育一株高产酸性蛋白酶的生产菌株，且所生产的酸性蛋白酶具有良好的耐酸性和耐热性，对推动新旧动能转换，产业结构升级具有重大意义。

发明内容：

本发明的目的是提供一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉诱变菌株及其液体发酵产酶方法。

本发明中所述的高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株具体为黑曲霉(Aspergillusniger)FSM-208063，该菌株已于2020年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20724。所述菌株是由保藏号为CGMCC NO.10789的黑曲霉经亚硝基胍诱变选育获得。

本发明所述的液体发酵技术主要包括以下步骤：

1)固体斜面培养基如下：酵母粉5g/L，蛋白胨2g/L，蔗糖40g/L，NaH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，KH₂PO₄ 4g/L，酪蛋白2g/L，琼脂15g/L，其余为水，调节pH至4.0，121℃灭菌20min，备用；

2)液体种子培养基配制如下：大豆浓缩蛋白30g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨 8g/L，蔗糖2g/L，NaH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，其余为水,调节pH至4.0，121℃灭菌20min；