[发明专利]一种毛囊干细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种毛囊干细胞培养方法，以完整毛囊的毛囊外根鞘隆突部，在毛囊干细胞培养基中进行培养并分离纯化得到。该培养方法周期短、操作简单、可行性高，适于商业化。

技术领域

本发明涉及本发明涉及基因工程技术及生物药物领域，尤其涉及一种毛囊干细胞培养方法。

背景技术

毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs)是存在于毛囊外根鞘隆突部中的一群能自我更新和增殖的多潜能干细胞，能分化成毛囊、皮脂腺、表皮，对毛发的再生起着重要的作用。研究表明，人毛囊干细胞表达多种细胞表面分子标记物如CD200、角蛋白15(keratin 15，K15)、角蛋白19(keratin 19，K19)、整合素α6、整合素β1、Nestin等，而不表达内皮细胞标志分子CD31；此外，也不表达小鼠毛囊干细胞的标记分子CD34。利用这些阳性和阴性标记分子，研究者们可以更好的分离纯化毛囊干细胞，这加快了毛囊干细胞的研究进程。与胚胎干细胞及其它成体干细胞相比，毛囊干细胞具有来源丰富、取材方便、对机体无损害、无伦理问题等优点。文献报道过，通过移植毛囊干细胞使裸鼠长出毛发，证明移植健康毛囊干细胞具有修复受损毛囊的潜力。

不过，毛囊干细胞在促进毛发再生方面可能有一套复杂的机制。Garza等发现患者脱发组织和未发生脱发的头皮组织毛囊干细胞的数量没有显著差异，但是脱发头皮组织中的毛囊干细胞不能产生让毛发生长的源细胞，这表明脱发头皮组织中的毛囊干细胞可能产生了缺陷。Matsumura等的研究则表明毛囊干细胞累积的DNA损伤会阻止其发挥作用。还有研究表明毛囊干细胞的增殖分化受其周围微环境影响；周围毛囊的信号会影响毛囊干细胞的活性，从而刺激毛囊生长。因此，对毛囊干细胞促进毛囊再生的作用机制进行研究，有助于推进其临床应用。此外，尽管毛囊干细胞有明确的细胞表面标记分子，但其分离培养的操作却比较复杂、时间周期也较长。鉴于此，本发明研究毛囊干细胞的培养方法，并探索利用异体毛囊干细胞治疗病理性脱发的可行性。

发明内容

本发明的目的是研究毛囊干细胞的培养方法，并探索利用异体毛囊干细胞治疗病理性脱发的可行性。

一种毛囊干细胞培养方法，其特征在于，以完整毛囊的毛囊外根鞘隆突部，在毛囊干细胞培养基中进行培养并分离纯化得到。

培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)所述完整毛囊取自脑后枕部，以青-链霉素的PBS液反复冲洗；

(2)在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，放到培养皿中；加入毛囊干细胞培养基，37℃、5％CO₂孵箱培养；

(3)次日补加等量培养基1.5mL，在倒置显微镜下观察毛囊外根鞘隆突部有无梭形生长的细胞爬出，待细胞融合达80％后传代培养；

(4)将上述毛囊干细胞消化，用毛囊干细胞培养液制成1.0×10⁵个/mL的毛囊干细胞悬液，计数。

(5)按1:1混合1.2％的琼脂糖和DMEM/F12培养基后，取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中备用。

(6)按1:1比例将0.7％琼脂糖和毛囊干细胞培养基在无菌试管中混合后，在向管中加入1/10体积的毛囊干细胞悬液，充分混匀，注入培养基I的培养皿中，加入量等于培养基I。

(7)2天一次更换培养基，总共培养10天，

进一步，所述毛囊干细胞培养液含10％FBS、100U/mL青链霉素双抗、2ng/mlbFGF的DMEM/F12。

进一步，所述培养基I，按1:1混合1.2％的琼脂糖和DMEM/F12培养基后，取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中备用。