[发明专利]一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法，其特征在于，检测IMN的方法包括以下步骤：

S1：从健康对照、IMN患者和非IMN患者的晨尿中分别获得尿液外泌体；

尿液外泌体通过晨尿经多次离心后获得；

S2：尿液外泌体的鉴定

鉴定所制备的尿液外泌体是否符合外泌体的形态、粒径特征；

S3：制备相同上样量的尿液外泌体蛋白样品

S4：采用免疫印迹法检测尿液外泌体的PLA2R蛋白

S5：结果判定：以正常对照免疫印迹灰度值的最高值为截断值，超过截断值的指示为IMN。

2.根据权利要求1所述的一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法,其特征在于，所述S1中获得尿液外泌体具体包括以下步骤：将受试者晨尿第一次经2000g离心20min去除脱落细胞及碎片，所获上清第二次经13500g离心30min去除微粒，所获上清经200000g超速离心2h，得到的半透明沉淀物即为尿液外泌体。

3.根据权利要求2所述的一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法,其特征在于，所述S2中尿液外泌体的形态采用透射电镜观察，具体包括以下步骤：

S21：吸取5ul尿液外泌体与5ul 4％的戊二醛混合固定20min；

S22：滴加到200目的载样铜网上，室温静置10min，用滤纸洗掉多余液体；

S23：用2％磷钨酸5ul染色5min，用滤纸洗掉多余液体；

S24：干燥后于透射电镜下成像拍照。

4.根据权利要求2所述的一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法,其特征在于，所述S2中尿液外泌体的粒径分布采用纳米颗粒跟踪分析仪测定。

5.根据权利要求3所述的一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法,其特征在于，所述S3中制备相同上样量的尿液外泌体蛋白样品具体包括以下步骤：用蛋白裂解液在冰上裂解外泌体30min，12000g离心30min，将所获上层清液移至干净1.5ml Ep管内，采用BCA法测定蛋白浓度；根据蛋白浓度，用裂解液稀释，加入上样缓冲液，配置成20μl体积、1μg/μl浓度的蛋白样品，充分混匀，100℃煮沸5min，冷却至室温后，样品制备成功。

6.根据权利要求5所述的一种基于尿液外泌体PLA2R检测IMN的方法,其特征在于，所述S4中采用免疫印迹法检测尿液外泌体PLA2R蛋白，具体步骤包括：进行SDS-PAGE电泳；将胶上的蛋白转移至PVDF膜上；5％BSA封闭1h；然后予试剂盒中的抗体室温孵育2h；TBS-T洗膜三次，每次10min；剂盒中的抗兔二抗室温孵育1h；TBS-T洗膜三次，每次10min；采用ECL化学发光液显影，以Tanon曝光机定时曝光30s所得条带为灰度值测定条带；采用image J测定目的条带灰度值。

7.根据权利要求6所述检测IMN的方法中的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的抗体为：针对尿液外泌体PLA2R的特异性抗体；试剂盒中的抗兔二抗为：针对PLA2R特异性抗体的二抗。

8.根据权利要求7所述试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒的应用包括以下步骤：

S10：在第一时间点测定IMN患者的尿液外泌体中PLA2R的水平；

S20：在第二时间点测定所述IMN患者的尿液外泌体中PLA2R的水平，第二时间点晚于第一时间点；

S30：比较两个时间点尿液外泌体PLA2R水平，与第一时间点相比，第二时间点尿液外泌体PLA2R水平下降表明治疗有效，水平不变或增加表明治疗无效。