[发明专利]一种快速提取囊泡DNA的方法

说明书

本发明提供了一种快速提取囊泡DNA的方法，属于核酸提取技术领域。方法包括：S1、取囊泡悬液置于80‑100℃的温度下进行水浴，然后在90‑110W的功率下进行超声破碎，得到破细胞悬液；S2、向所述破细胞悬液中加入氯仿混匀，静置一段时间后离心取上清液，得到囊泡DNA。本发明的整个操作过程简单，步骤较少，所需时间不到30min，大大简化了囊泡内游离DNA的提取流程同时提高了囊泡内游离DNA的提取效率和提取纯度。

技术领域

本发明涉及核酸提取技术领域，特别涉及一种快速提取囊泡DNA的方法。

背景技术

细胞骨架是真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，细胞在受到外源性或内源性刺激之后会引起细胞骨架发生重排，导致细胞膜局部受力不均匀。受力异常的胞质会向胞外膨胀，进而随机包裹部分细胞内容物后以囊泡的形式释放到细胞外部，这种直径约为0.1-1μm的特殊亚细胞结构称为“细胞囊泡”。中国专利CN102302784B及其系列专利公开了使用紫外线照射肿瘤细胞或者使用化疗药物与肿瘤细胞共孵育以诱导肿瘤细胞凋亡，进而获得细胞囊泡的方法。该方法制备的细胞囊泡携带有原肿瘤细胞的生物活性分子，如DNA、RNA和蛋白质，表现出原肿瘤细胞的分子生物印记，可以有效地激活机体免疫应答。研究表明，囊泡中的DNA来自游离于细胞内的、部分降解了的机体内源性DNA，其片段长度远小于基因组DNA，集中在0.18-21kb之间，并且这些DNA所携带的基因信息在某种程度上与肿瘤细胞DNA具有一致性，对研究疾病的发生发展、早期诊断、预后、检测都具有重要的意义。而获得性质稳定、纯度高的囊泡DNA是是开展上述研究工作的先决条件。

目前，在提取囊泡DNA时，通常参考外泌体内容物的提取步骤。但是，现有的外泌体DNA提取步骤操作复杂，待提取DNA的样品首先需要在裂解液(Buffer ATL)和蛋白酶作用下裂解消化，以将DNA释放到裂解液中，然后加入Buffer AL和乙醇后，转移至柱子中过滤，使DNA被吸附在柱子的膜上，而蛋白质则不被吸附并随溶液滤出除去。柱子经Buffer GW1洗涤蛋白质和其它杂质，经Buffer GW2洗涤去除盐分，最后DNA被低盐缓冲液(Buffer AE)洗脱。完成整个操作所需时间超过1小时，提取效率低下，不适用于囊泡DNA的大规模提取。

发明内容

针对以上现有技术中囊泡DNA提取效率低的问题，本发明提供了一种快速提取囊泡DNA的方法。

为实现上述目的，本发明具体通过以下技术实现：

一种快速提取囊泡DNA的方法，包括以下步骤：

S1、取囊泡悬液置于80-100℃的温度下进行水浴，然后在90-110W的功率下进行超声破碎，得到破细胞悬液；

S2、向所述破细胞悬液中加入氯仿混匀，静置一段时间后离心取上清液，得到囊泡DNA。

进一步地，步骤S1中，在95-105W的功率下进行超声破碎。

进一步地，步骤S1中，所述超声破碎的工作模式选择间歇式的方式，所述间歇式的方式为工作1-5s、间歇1-5s，占空比为50％。

进一步地，步骤S1中，所述超声破碎的时间为2-10min。

进一步地，步骤S1中，所述水浴时间为2-10min。

进一步地，步骤S1中，所述囊泡悬液置于90℃的温度下进行水浴。

进一步地，步骤S1中，所述囊泡悬液中囊泡的浓度为3×10¹⁰-6×10¹⁰个/mL。

进一步地，所述囊泡悬液由肿瘤细胞凋亡后产生。

进一步地，步骤S2中，所述破细胞悬液与所述氯仿的体积比为1.5-5：1。

进一步地，步骤S2中，所述离心条件为：12000g离心10min。