[发明专利]抗鸡SAMHD1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体与应用

说明书

本发明公开了一株能够稳定分泌抗鸡SAMHD1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A8‑2‑1，及其分泌产生的抗体与应用。所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A8‑2‑1的保藏编号：CCTCC NO:C2020250。IFA和Western blot检测结果表明，此杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体与鸡SAMHD1蛋白具有高度的特异性反应。进一步应用结果表明，鸡SAMHD1蛋白具有抗病毒活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地讲，涉及一株能够稳定分泌抗鸡SAMHD1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，及其分泌产生的抗体与应用。

背景技术

不育-ɑ-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(sterilealpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein 1，SAMHD1)是真核细胞内的一种天然免疫限制因子。其中SAM结构域内含40～109位氨基酸残基，在蛋白-蛋白或蛋白-DNA/RNA之间的相互作用中发挥重要作用，此外SAM结构域有助于HD结构域高效地发挥脱氧核苷三磷酸水解酶(dNTPase)活性及核糖核酸酶(RNase)活性。HD结构域内含110～599位氨基酸残基，存在于具有预测或已知磷酸水解酶活性的多种超家族酶中，具有dNTPase活性，可水解病毒RNA、DNA转录和复制所必需的原料物质脱氧核苷三磷酸盐(dNTPs)，进而介导SAMHD1发挥抗病毒作用。SAMHD1的活性形式为四聚体，形成四聚体化的能力对于SAMHD1的dNTPase活性尤为重要。SAMHD1具有广谱的抗逆转录病毒(如HIV-1/2、MLV)和DNA病毒(如HBV、HSV-1)功能，其抗病毒的作用机制涉及dNTPase活性和RNase活性，前者通过降低细胞内dNTPs水平，消耗病毒复制所需的“原料库”进而抑制病毒的复制，后者受T592位磷酸化影响，通过降解病毒的基因组RNA发挥抗病毒作用。机体内SAMHD1所具有的双重酶活性由dGTP介导，当dGTP含量降低时，SAMHD1以单体或二聚体形式存在，具有RNase活性；当dGTP含量升高时，SAMHD1由dGTP介导形成四聚体而具有dNTPase活性。除了具有抗病毒活性外，近年来的研究发现，SAMHD1在肿瘤的发生、发展、DNA损伤修复、内源性逆转录因子转座活性抑制及固有免疫应答调控等生理过程中均发挥着重要作用。

迄今为止，关于SAMHD1结构功能、生物学特性、调控机制等方面的研究主要集中在人源蛋白，此外研究发现灵长类动物、鼠源、猪源的SAMHD1同样能够抵抗外源病毒感染，而关于鸡源SAMHD1(chSAMHD1)的研究相对较少。近期研究发现chSAMHD1同样具有dNTP水解酶和核酸酶活性，推测其具有抗病毒功能。对其开展功能及特性的研究，对防控家禽重大疫病具有重要意义。目前现有的人源、猪源等SAMHD1单克隆抗体与chSAMHD1几乎没有反应性。因此，需要制备具有良好免疫原性的chSAMHD1蛋白和具有良好反应性的抗chSAMHD1单克隆抗体，以实现对禽类SAMHD1蛋白功能的深入研究。

发明内容

本发明是要解决没有良好免疫原性的chSAMHD1蛋白和良好反应性的抗chSAMHD1单克隆抗体的技术问题。为了实现本发明的目的，拟采用如下的技术方案：

本发明以SPF鸡外周血单个核细胞RNA反转录产物为模板，通过设计特异性引物，扩增出SAMHD1基因并克隆至pMD19-T载体。测序鉴定正确后，通过EcoRI和XhoI酶切，亚克隆到pET-28a(+)载体，构建重组原核表达载体pET-chSAMHD1。以pET-chSAMHD1为模板，将EcoRI和XhoI酶切产物亚克隆到pCAGGS载体，构建重组真核表达载体pCAGGS-chSAMHD1。

将原核表达载体pET-chSAMHD1转化Rosseta感受态细胞，增菌培养，加入IPTG诱导表达，通过对表达条件的优化和鉴定，获得分子质量为74kD的重组蛋白chSAMHD1，并采用Ni-NTA His*Bind Resin进行蛋白纯化并超滤浓缩。