[发明专利]一种岷江百合几丁质酶基因LrCHI2及其应用

说明书

本发明公开了一种岷江百合几丁质酶基因LrCHI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。本发明通过功能基因组学相关技术研究证实LrCHI2基因具有提高植物对病原真菌抗性的功能。将本发明抗真菌基因LrCHI2构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，超表达LrCHI2的转基因烟草有着较强的抗稻黑孢霉、织球壳菌、尖孢镰刀菌侵染的能力。

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种具有抗真菌侵染能力的岷江百合几丁质酶基因LrCHI2及其应用。

背景技术

植物体拥有多种保护自身免受各种病原体侵害的机制。在植物体受到病原体攻击时，植物通过迅速改变基因表达来对病原菌和外部胁迫做出反应，诱导一些特殊蛋白的重新合成，其中大部分是病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)，这类蛋白是植物防御体系的重要组成部分。PRs在植物中主要表现为几丁质酶(chitinase, CHI)、葡聚糖酶(dextranase)和类甜蛋白(thaumatin-like proteins, TLPs)等。根据氨基酸序列、血清学关系和生物活性，将PR蛋白分为17类(Kaur A, Pati PK, Pati AM, Nagpal AK.In-silico analysis of cis-acting regulatory elements of pathogenesis-relatedproteins of Arabidopsis thaliana and Oryza sativa. Plos One. 2017, 12(9):e0184523.)。PR3基因家族编码的几丁质酶在植物抗病防卫反应中备受关注。

几丁质，又称甲壳素或甲壳质，以N-乙酰-D-氨基葡萄糖为单体，以β-1, 4-糖苷键连结而成的生物多聚体，是自然界中除纤维素外储量最大的生物多聚糖。在自然界几丁质广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物中，是绝大部分真菌细胞壁的结构物质，占细胞壁干重的40%～60%，但在高等植物中尚未发现有几丁质的存在。几丁质酶是广泛存在于微生物和植物体内的一类蛋白质，是植物体中与防御有关的一种次生水解酶。由于在大部分真菌的细胞壁中含有几丁质，而植物细胞中不含几丁质，却有几丁质酶，故认为它能催化真菌细胞壁的重要成分几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。植物几丁质酶属于一种诱导性酶，在正常情况下表达量很低或者不表达(Dana M,Pintor J, Cubero B. Transgenic tobacco plants overexpressing chitinases offungal origin show enhanced resistance to biotic and abiotic stress agents.Plant physiology. 2006, 142(2): 722-730.)。植物几丁质酶存在于植物的根、茎、种子、花中，它们的表达存在组织特异性。大多植物几丁质酶相对分子质量都比昆虫几丁质酶相对分子质量小，其中最小的几丁质酶大小为22 kDa。植物几丁质酶根据氨基酸的数量、结构特征和酶的活性特征被划分为6类。其中，Class Ⅰ几丁质酶具有N-端富含半胱氨酸的几丁质结合区、C-端催化区以及结合区和催化区连接的可变区的结构特征。ClassⅡ几丁质酶主要有烟草(Nicotiana tabacum)酸性同功酶(PR-P和PR-Q)、大麦(Hordeum vulgare)几丁质酶和矮牵牛(Petunia hybrida)几丁质酶，定位于细胞间隙，含有催化区，但缺少几丁质结合区及交连区，有些成员还保留了部分交连区。Class Ⅲ几丁质酶既具有溶菌酶活性又具有几丁质酶活性，但与Class Ⅰ和Class Ⅱ无同源性，无几丁质结合区，一般位于细胞间隙。Class Ⅳ几丁质酶有甜菜(Beta vulgaris)碱性几丁质酶，菜豆(Phaseolus vulgaris)酸性PR-4几丁质酶，由几丁质结合区、交连区及催化区组成。近年来，随着对其作用机理、生化性质、表达调控的深入研究，利用几丁质酶基因培育抗真菌植物新品种成为植物防御真菌病害的一种有效途径。正是由于几丁质酶在植物抗真菌病害中起着重要的作用，因而成为近年来抗真菌病害研究的热点之一。