[发明专利]一种利用基因组合转化制备稀有人参皂苷CK的方法及应用

说明书

本发明公开了一种利用基因组合转化制备稀有人参皂苷CK的方法及应用。本发明利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis str.168）和双歧杆菌（Bifidobacterium breve 689b）的基因所产生的糖苷酶在体外能够高效率转化人参皂苷Rc为稀有人参皂苷CK。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种利用基因组合转化制备稀有人参皂苷CK的方法及应用，具体涉及一种利用大肠杆菌共表达枯草杆菌α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和双歧杆菌β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rc制备稀有人参皂苷CK的方法。

背景技术

人参皂苷是人参中最重要的活性成分，人参皂苷属于四环三萜类化合物，根据其苷元上C-3、C-6和C-20位置的糖苷键(Glycosidic bond)的种类和数量的不同，人参皂苷可分为达玛烷型和齐墩果酸型皂苷，其中达玛烷型皂苷又分为原人参二醇型皂苷(PPD型皂苷，主要包括包括Rb1，Rb2，Rc和Rd等)和原人参三醇类皂苷(PPT型皂苷，包括Re和Rg1等)。根据人参皂苷在植物中的含量高低分为主要人参皂苷(Major ginsenoside，如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1等)和稀有人参皂苷(Rare ginsenoside，如Rg3、Rh1、Rh2、F1、F2、CK、C-O、CY和C-Mc)等。迄今，在人参植物中已发现了100余种人参皂苷。但是，Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1占总皂苷的80％以上，这些主要的人参皂苷分子通常含有含3～4个糖基，由于其糖基多，很难被人体直接吸收，导致生理活性普遍比糖基少的稀有人参皂苷低。

在目前已知的人参皂苷中，低糖基的人参稀有皂苷如F2、Rg3、Rh2和CK等在人体中的吸收率高。这些稀有人参皂苷在抗癌、抗肿瘤、抗血栓、提高免疫、抗炎、抗衰老、抗糖尿和抗焦虑、预防和缓解老年痴呆等方面具有重要的应用价值。研究表明人参皂苷CK具有很好的抗细胞突变、抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞耐药性和抗肿瘤诱导的血管生成等方面具有其它人参皂苷无法取代的独特优势。它与放疗和化疗结合试验，可以增强放疗和化疗的效果。除此之外，人参皂苷CK还有具有抗过敏和抗炎活性，并且可以起到神经保护作用，抗糖尿病作用和抗皮肤衰老作用。并且人参皂苷CK的药理活性具有多靶点、高活性和低毒性的特点。

为了获得糖基含量低的高活性人参稀有皂苷，已有大量的利用肠道细菌、微生物和克隆酶转化等方面的研究报道。研究发现，人参皂苷CK是原人参二醇型皂苷在服用后，是人肠道内的最主要的代谢产物。而且大多数原人参二醇型皂苷只有被代谢为CK后才能被人体吸收，所以人参皂苷CK原人参二醇型皂苷在体内发挥药理作用的真正分子，而其它二醇型人参皂苷只是药物前体。虽然人参皂苷CK在人体中发挥十分重要的药理活性，但由于它们在自然界中含量极其稀少，通过传统的方法从人参等植物中分离变得十分困难，这对稀有人参皂苷CK的利用带来了很大限制。

根据主要人参皂苷的结构看，和稀有人参皂苷的主要差异在于糖基的种类和位置不同。目前，关于稀有人参皂苷制备方面的研究，主要采用的是化学水解法和糖苷酶生物转化法。我们熟知的化学水解法选择性差、产率低、不易纯化、同时容易造成环境污染。利用生物体所产生的特定类型的糖苷酶转化制备稀有人参皂苷，具有选择性好、得率高、副产物少、无污染和易于规模化生产等优势。虽然生物转化的方法需要经历的途径比较复杂，但是可以获得化学法难以得到的稀有人参皂苷如CK。