[发明专利]一种TMPRSS2突变体蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法

说明书

本发明实施例提供了一种TMPRSS2突变体蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法，所述TMPRSS2突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述表达载体的表达区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述工程菌包含所述的TMPRSS2突变体蛋白表达载体。野生型TMPRSS2蛋白由于本身可在Arg255和Ile256间进行自我切割进行活性形式的转化，故野生型蛋白TMPRSS2存在自我剪切，蛋白纯度不高。本发明实施例通过点突变实现哺乳细胞表达的TMPRSS2蛋白突变体，并成功表达纯化，获得了TMPRSS2高纯度高活性蛋白。

技术领域

本发明实施例属于生物技术领域，涉及一种TMPRSS2突变体蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法。

背景技术

TMPRSS2是II型跨膜丝氨酸蛋白酶的成员之一，是一类定位于细胞膜上具有保守丝氨酸蛋白酶结构域的蛋白家族。该家族基本结构却高度相似，均含有四部分，从N端到C端依次为短细胞质结构域、跨膜结构域、主干区和丝氨酸蛋白酶结构域，其蛋白酶催化结构域包含His296、Asp345和Ser441氨基酸残基。其拥有单跨膜结构域，其中主干区和丝氨酸蛋白酶结构域位于胞外，不同成员区别主要集中于主干区。C端蛋白酶结构域在胞外，N端位于胞内。由于蛋白酶可降解细胞外基质，增加细胞在组织内迁移和扩散，TMPRSS2参与了癌细胞的增殖、侵袭和转移。目前发现TMPRSS2与前列腺癌的发生密切相关。

此外，目前也发现TMPRSS2在2019年爆发的SARS-COV-2病毒入侵宿主机制中，起到重要作用。SARS-CoV-2进入细胞依赖于与宿主细胞ACE2受体的结合，而TMPRSS2会对SARS-CoV-2的刺突蛋白S进行剪切活化，启动S蛋白，促进SARS-CoV-2的入侵，促进SARS-CoV-2和ACE2的膜融合过程。同时，人们也发现TMPRSS2蛋白在H7N9流感病毒和几种H1N1亚型流感病毒，以及SARS和MERS冠状病毒感染中起着关键作用，提示TMPRSS2可作为抗病毒的一个潜在靶标，可能是治疗冠状病毒和一些低致病性流感病毒感染的新的抗病毒策略。虽然TMPRSS2发现时间不长，且作用机制和生理功能还未完全阐明，但使用遗传学及相关方法已发现多个成员功能异常可导致疾病的发生，突出了它的重要性。

随着新冠状病毒在全球愈演愈烈，制备具有活性的TMPRSS2蛋白，并研究其酶活作用对于我们理解新冠病毒感染机制以及开展药物筛选和疫苗研究都具有现实意义。但目前市面上可选择的TMPRSS2的相关产品并不多见，由于TMPRSS2本身可在Arg255和Ile256间进行自我切割进行活性形式的转化，大部分成熟蛋白是膜结合的，有部分会释放在细胞外环境。所以获得高纯度高活性的蛋白难度相对较高，故野生型蛋白存在自我剪切，蛋白纯度不高。

因此，如何开发一种高纯度高活性的TMPRSS2突变体蛋白，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种TMPRSS2突变体蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法，本发明通过点突变实现哺乳细胞表达的TMPRSS2蛋白突变体，并成功表达纯化，获得了TMPRSS2高纯度高活性蛋白。

在本发明的第一方面，提供了一种TMPRSS2突变体蛋白表达载体，所述表达载体的表达区的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的第二方面，提供了所述的TMPRSS2突变体蛋白表达载体的制备方法，所述方法包括：

获得TMPRSS2突变体蛋白的优化密码子片段，所述优化密码子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

获得表达载体，将所述TMPRSS2突变体蛋白的优化密码子片段插入到所述表达载体的表达区，获得TMPRSS2突变体蛋白表达载体。