[发明专利]一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法

权利要求书

1.一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法，其特征在于包括如下步骤：

A、供试菌株及紫花苜蓿品种选择

供试菌株分离于紫花苜蓿种子，经鉴定为成团泛菌（Pantoea agglomerans），编号CQ10；以内含中华根瘤菌（Sinorhizobium medicae，SM）的“巨能551”紫花苜蓿种子为供试材料，种样于5℃恒温保；

B、供试培养基

营养琼脂培养基NA，用于成团泛菌的纯化培养 ；

C、成团泛菌脂多糖的提取

细菌脂多糖的提取采用在NA培养基上活化48 h后的菌株，使用贝博生物科技有限公司BBproExtra脂多糖提取试剂盒，提取成团泛菌脂多糖；

D、成团泛菌脂多糖的活性检测

制备1 EU/mL内毒素溶液，进行标准系列稀释，将内毒素标准品稀释成0.01、0.025、0.05、0.1 EU/mL 4个浓度梯度，内毒素检查用蒸馏水作空白对照，定量法鲎试剂测定脂多糖活性，具体参照GenScript的ToxinSensor^TM Endotoxin Detection System试剂盒说明书进行操作，计算成团泛菌脂多糖的活性；

E、组培发芽试验

E1、参照《牧草种子检验规程GB/T 2930.4-2001》挑选籽粒饱满、无病虫害的干净种子25粒，质量浓度3%的NaClO消毒5 min、质量浓度75%的酒精消毒1 min，无菌水冲洗3~4次，重复制作4个；

E2、玻璃组培发芽瓶，高度10.0 cm、直径8.0 cm，中加入200ml蒸馏水和不同浓度的脂多糖，正面放置发芽床，121℃高温0.11 Mpa高压灭菌锅灭菌21 min；

E3、发芽试验种子分为消毒和未消毒两个处理，未消毒组不作任何处理，处理组每玻璃组培发芽瓶加入1 ml 成团泛菌脂多糖LPSp，脂多糖浓度为0.267 EU/mL，记为A处理；无菌水处理作为对照组，记为CK；每瓶接入25粒种子，重复制作4个，在温度23℃、湿度45%、23.5Klux光照18h加黑暗6 h的组培室进行培养，接种后需观察对照组和处理组种子生长状态及统计种子第7 d发芽势、第30 d发芽率和发芽指数，第30 d取样测定紫花苜蓿植株鲜重、干重、苗长、根长、叶绿素指标；种子萌发的标准为胚根突破种皮，长出0.3 cm长的白色种根，

测定指标：种子发芽率GR=（发芽的种子数/25）×100%；发芽势GP=发芽高峰期发芽的种子数/供试种子数×100%；发芽指数GI= ∑Gt/ Dt，Gt为当天的发芽数；Dt为发芽日数。

2.根据权利要求1所述一种促进紫花苜蓿快速结瘤的方法，其特征在于还包括如下步骤H、数据分析

采用SPSS 13.0分析软件分析种子的发芽率、根长、苗长、鲜重指标并使用ANOVA进行显著性分析。