[发明专利]一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官及其培养方法和应用

权利要求书

1.一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括针对鼻黏膜上皮细胞，采用U形底类器官培养法或胶汽液平类器官培养法进行培养；

所述U形底类器官培养法具体为：

将鼻黏膜上皮细胞重悬于类器官培养基中，接种于设置有U型底的细胞培养器皿中，离心后进行培养；

所述胶汽液平类器官培养法具体为：

使用类器官培养基将基质胶稀释并包被于细胞培养器皿中孵育得培养基A；将鼻黏膜上皮细胞重悬于含基质胶的类器官培养基中，然后接种于所述培养基A中进行培养；

所述类器官培养基，其成分和含量如下：DMEM/F12，1~5×；人表皮生长因子，5~20 ng/mL；胰岛素，1~10 ng/mL；霍乱毒素，0.05~0.2 nM；皮质醇，0.1~1 μg/mL；3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸，1~5 nM；N-2细胞培养添加剂，5~15μL/mL；抗生素-抗真菌溶液，50~200 IU/mL；B27细胞培养添加剂，1~5×；重组人头蛋白50~200 ng/mL；

所述U形底类器官培养法中：

将鼻黏膜上皮细胞重悬于类器官培养基中，控制其浓度为1~5×10³；所述设置有U型底的细胞培养器皿为96孔培养板；所述离心控制条件为1000~2000rpm离心1~5分钟；当类器官生长到200μm以上，在培养的第7天加入分化培养基诱导分化；所述分化培养基为人支气管上皮细胞气液界面培养基，1~5×；

所述胶汽液平类器官培养法中：

培养基A为含40%基质胶的类器官培养基；所述细胞培养器皿为24孔培养板；所述孵育为在35~40℃条件下孵育10~30分钟；所述步骤“将鼻黏膜上皮细胞重悬于含基质胶的类器官培养基中”，基质胶含量控制为1~10%；在培养的第7天，类器官的大小达到200〜300μm；采用酶解并反复吹打，从而机械性地将类器官分离，此时类器官大小为100μm；然后加入类器官培养基，离心，重悬于含50~70%基质胶的类器官培养基中，并加入分化培养基诱导分化，然后使用胶包埋的方法对类器官进行传代培养，稀释后在细胞培养器皿中重悬接种，添加分化培养基，完全覆盖固化的基质胶液滴；所述分化培养基为人支气管上皮细胞气液界面培养基，1~5×。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述U形底类器官培养法中，所述离心控制条件为1500rpm离心2分钟。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述胶汽液平类器官培养法中，所述孵育具体为37℃孵育20分钟。

4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述胶汽液平类器官培养法中，所述步骤“将鼻黏膜上皮细胞重悬于含基质胶的类器官培养基中”，基质胶含量控制为5%。

5.权利要求1-4任一项所述培养方法获得的鼻黏膜上皮细胞3D类器官。

6.权利要求5所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官在药物体外筛选和/或检测中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物体外筛选为体外药物高通量筛选。

8.一种体外检测平台，其特征在于，所述体外检测平台包含权利要求5所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官。

9.一种体外高通量药物筛选的方法，其特征在于，所述方法包括：将待测药物施加至权利要求5所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官和/或权利要求8所述体外检测平台，对所述鼻黏膜上皮细胞3D类器官和/或体外检测平台进行检测分析；

所述检测分析方法包括荧光染色、RNA提取、图像捕获和生物标记分析。