[发明专利]一种蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR检测试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)血清型鉴定的RT‑qPCR试剂盒，属于兽医传染病检测技术领域。所述RT‑qPCR试剂盒主要用于12种血清型的蓝舌病病毒的血清型鉴定，所述蓝舌病病毒的12种血清型分别为BTV‑1、BTV‑2、BTV‑3、BTV‑4、BTV‑5、BTV‑7、BTV‑9、BTV‑12、BTV‑15、BTV‑16、BTV‑21和BTV‑24。所述RT‑qPCR试剂盒包括：用于特异性扩增12种血清型的BTV毒株Seg‑2基因序列的引物对组合，以及相应的探针组合。本发明的检测试剂盒和方法具有灵敏度高、特异性强、检测通量高、操作简便快捷的特点，可用于BTV血清型鉴定，以实现对临样本中BTV血清型的准确鉴定。

技术领域

本发明属于兽医传染病检测技术领域，具体地，涉及一种蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR检测试剂盒和检测方法。

背景技术

蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)感染引起的蓝舌病(Bluetongue，BT)是一种严重侵害反刍动物的烈性出血性虫媒病毒病。BT的暴发可给牛羊养殖业带来巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(Office international des epizooties,OIE)列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。BTV主要通过库蠓(Culicoides spp.)的叮咬传播，可感染大多数家养和野生反刍动物。牛和山羊感染BTV后，往往呈隐性感染，成为病毒重要的储存宿主与传染源。BTV感染绵羊可引起明显的BT临床症状，主要表现为高热、消瘦、口唇充血肿胀及糜烂、鼻腔和胃肠黏膜出血溃疡、蹄冠脱落引起跛行等症状。BT疫情暴发时，感染绵羊的发病率可达80％，死亡率可高达40％，给牛羊养殖业带来毁灭性损失。

BTV隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)，目前世界范围已发现27种血清型的BTV(BTV-1至BTV-27)。病毒的基因组大小约20kb，由10个节段(Seg-1～Seg-10)的双链RNA(Double stranded RNA，dsRNA)组成，可编码7种结构蛋白(VP1-VP7)与5种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a与NS4)。Seg-2编码的VP2蛋白是构成病毒外层衣壳的主要蛋白，可诱导感染动物产生特异性中和抗体，决定着BTV的血清型。Seg-2/VP2具有高度变异的特性，序列分析显示不同血清型BTV毒株的Seg-2核酸序列差异度在38.6％～59.5％之间，VP2蛋白氨基酸序列差异度在40.5％～70.9％之间；同一种血清型BTV毒株之间Seg-2/VP2的序列差异度也可达31.6％/27.4％，在系统发生树上可将同一种血清型BTV的Seg-2分为“Eastern”(东方)和“Western”(西方)两种地域型。

2012年以来，专利申请人在我国云南省、广东省、广西壮族自治区、江苏省、湖南省、山西省、新疆维吾尔族自治区与内蒙古自治区开展了全国范围的BTV流行病血调查研究，分离出12种血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21、-24型)的BTV共计300余株。对我国流行的不同血清型BTV毒株Seg-2基因序列分析表明，我国流行的BTV-1、-2、-3、-4、-9、-16与-21等七种血清型BTV的Seg-2与日本和澳大利流行毒株具有最近的亲缘关系，核酸序列相似度94％，均属于Eastern型；而我国流行的BTV-5、-7与-24的Seg-2与南非毒株具有最近的亲缘关系，核酸序列相似度92％，属于Western型。多种血清型BTV在我国的广泛流行，给我国BT的防控带来了严峻挑战。建立特异性强、灵敏度高、可进行高通量检测的BTV血清型检测技术，是开展我国BTV流行病学研究，进而制定BTV科学防控策略的前提。

血清中和试验是BTV血清型鉴定的传统方法，存在耗时、费力与实验成本高等方面的不足。常规RT-PCR是病毒核酸检测广泛使用的方法，具有简便快捷的优点，但是该方法灵敏度较差，主要适用于分离病毒的检测，难以有效对病原核酸含量低的临床样本进行检测。

发明内容