[发明专利]深度鉴定马铃薯癌肿病原菌和种内DNA分型的方法

权利要求书

1.一种深度鉴定马铃薯癌肿病原菌和种内DNA分型的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：病原菌样品收集

先对马铃薯癌肿病的相关信息进行调查和数据采集，然后在调查和信息数据采集的基础上，采集两种不同类型的癌肿病感病样品，一是患有癌肿病的马铃薯薯块，二是马铃薯癌肿病菌污染区域土壤样品；

步骤二：孢子囊富集

先采用氯仿抽提法分别对癌肿病马铃薯块和癌肿病菌污染区域土壤样品中的内生集壶菌孢子囊进行富集，得到两种富集样品，并对富集条件进行优化，建立可靠有效的方法对两种富集样品进行预处理；

步骤三：PCR法鉴定病原菌分子

先利用显微镜观察富集样品中内生集壶菌孢子囊的形状和大小，再对孢子囊的数量进行统计，接着对显示阳性结果的样品进行DNA提取，利用已知的真菌通用引物、内生集壶菌的特异性引物扩增ITS序列和SSU序列，以此鉴定菌种，然后接种感染已收集的马铃薯品种，最后记录不同品种马铃薯对内生集壶菌的抗病和染病情况，初步评价国内内生集壶菌的致病类型，同时发现高抗和易感病原菌的马铃薯品种；

步骤四：内生集壶菌基因组测序

先从易感染癌肿病的马铃薯块中制备大量的孢子囊，再通过制备的孢子囊制备DNA样品，接着进行内生集壶菌基因组深度测序和组装；

步骤五：基于GBS重测序的基因分型

先对内生即壶菌进行GBS测序分析，获得低覆盖度的基因组序列，再建立该菌种内的SNP数据库，利用主成分分析法进行种内特异性SNP位点分析；

步骤六：全转录组测序和基因表达数据的分析

先对不同感染程度和不同感染时间的RNA样品进行全转录组测序，接着将测序数据进行raw reads过滤、基因组映射、表达量计算以及生物学重复间基因表达相关性分析，得到两组不同样本间基因表达量矩阵，然后在此基础上分析感染后的马铃薯薯块组织与对照间的差异表达基因；

步骤七：共表达基因网络构建与表达模式分析

先利用两个不同的基因差异表达矩阵同时构建两个共表达基因网络，并在所有感染癌肿病薯块和正常薯块的差异表达基因中找到具有相同表达模式和相同调控功能的基因聚类，再根据基因相互间的生物学相关性，鉴定与癌肿病感染途径和通路相关的功能和调控基因富集的基因模块，并通过两个网络间聚类模块的比较，揭示保守的基因表达模式以及感病途径中基因间相互调控关系，最后挖掘基因网络中起关键调控作用的核心基因和转录因子。

2.根据权利要求1所述的深度鉴定马铃薯癌肿病原菌和种内DNA分型的方法，其特征在于：所述步骤一中，马铃薯癌肿病的相关信息包括马铃薯癌肿病的发病区域、危害程度、立地条件、寄主品种以及当地的气候和土壤特性。

3.根据权利要求1所述的深度鉴定马铃薯癌肿病原菌和种内DNA分型的方法，其特征在于：所述步骤三中，接种感染已收集的马铃薯品种时参考EPPO标准，并按照Glynne-Lemmerzahl方法进行，接种感染后设置3个重复，并在25天后记录结果。

4.根据权利要求1所述的深度鉴定马铃薯癌肿病原菌和种内DNA分型的方法，其特征在于：所述步骤四中，内生集壶菌基因组的深度测序和组装通过三代测序技术进行，组装完毕后再对内生集壶菌基因组进行功能注释。

5.根据权利要求1所述的深度鉴定马铃薯癌肿病原菌和种内DNA分型的方法，其特征在于：所述步骤六中，RNA样品的制备过程为，先依次提取薯块肿瘤部位内侧面组织RNA并进行全转录组测序，接着在每个感染级别以及感染时间的样本间设置3个生物学重复，并在每组材料中均选择3个未感染的马铃薯薯块组织为对照，得到不同感染程度和不同感染时间的RNA样品。

6.根据权利要求1所述的深度鉴定马铃薯癌肿病原菌和种内DNA分型的方法，其特征在于：所述步骤六中，两组不同样本间基因表达量矩阵分别为不同感染程度薯块基因表达矩阵以及不同感染时间薯块基因表达矩阵。

7.根据权利要求1所述的深度鉴定马铃薯癌肿病原菌和种内DNA分型的方法，其特征在于：所述步骤七中，两个共表达基因网络分别为不同感染程度薯块的共表达基因网络以及不同感染时间薯块的共表达基因网络。