[发明专利]一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇超灵敏检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇检测方法，该方法包括以下步骤：

S1. 构建复合DNA修饰的磁珠

将3'端生物素标记的适配体和cDNA混合，得到复合DNA，将链霉亲和素修饰的磁珠与所述复合DNA混合，得到复合DNA修饰的磁珠；

所述适配体为17β-雌二醇适配体，所述cDNA为17β-雌二醇适配体的互补序列；

S2. 合成环DNA

将用于滚环扩增的锁式探针和引物探针混合，加入DNA连接酶进行连接，然后加入核酸外切酶去除未环化的锁式探针和引物探针，得到环DNA；

S3. 多步等温循环扩增

将含有17β-雌二醇的待测溶液与复合DNA修饰的磁珠混合反应，反应后将溶液进行磁分离，取溶液的上清液，加入模板DNA、链置换扩增用限制性核酸内切酶、具有链置换活性的DNA聚合酶和dNTPs混合孵育反应后，加入环DNA、滚环扩增用酶、dNTPs、分子信标进行滚环扩增和分子信标的识别；然后采用荧光分光光度计测荧光值；

其中，所述模板DNA能够与cDNA特异性识别并经链置换扩增生成ssDNA；所述ssDNA能够与环DNA特异性识别，启动RCA-多引物RCA反应，生成L-ssDNA；所述分子信标能够与L-ssDNA特异性识别，并通过结合L-ssDNA恢复其荧光；

所述含有17β-雌二醇的待测溶液由待测样品制备，所述待测样品为自来水、污水、牛奶、酸奶或奶酪；

所述适配体的序列为5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCT CTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-Biotin-3'（SEQ ID NO：1）；

所述cDNA的序列为5'-AAAATTTAAAATGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3'（SEQ ID NO：2）；

所述锁式探针的序列为5'-Phosphate-ATTGAATTACACCTCAGCCCCTACCA TTATTAATAGACTGCCTCAGCCACCATCACCTTTGCTATTTAACCTCAGCGCTTCCAGCTT-3'（SEQ ID NO：3）；

所述引物探针的序列为5'-TGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3'（SEQ ID NO：4）；

所述模板DNA的序列为5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACCTCAGCTTCCAGCTT ATTGAATTACA-3'（SEQ ID NO：5）；

所述ssDNA的序列为5'-CTGAGGCAGTCTATTAATAATGGTAGGGGCTGAG-3'（SEQ ID NO：6）；

所述L-ssDNA为多重复单元序列，其中一个重复单元序列为5'-GCTGAGGTTAAATAGCAAAGGTGATGGTGGCTGAGGCAGTCTATTAATAATGGTAGGGGCTGAGGTGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3'（SEQID NO：7）；

所述分子信标的序列为5'-FAM-ATGACTACACCATCACCTTTGCTATTTAATAGT CAT-BHQ1-3'（SEQ ID NO：8），两端分别修饰有荧光基团和淬灭基团;

所述方法用于非疾病诊断目的。

2.根据权利要求1所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇检测方法，其中，步骤S1中，3'端生物素标记的适配体和cDNA的摩尔比为1:1-4。

3.根据权利要求1所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇检测方法，其中，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照步骤S1-S3，检测一系列已知浓度的17β-雌二醇，测得多个荧光值，分别以浓度和荧光值作为横纵坐标作图，得到标准曲线。

4.根据权利要求3所述的基于多步等温循环扩增的17β-雌二醇检测方法，其中，该方法还包括：基于标准曲线，计算含有17β-雌二醇的待测溶液中17β-雌二醇的浓度。