[发明专利]CRISPR/xCas9基因编辑系统在棉花中的应用

说明书

本发明公开了CRISPR/xCas9基因编辑系统在棉花中的应用，技术方案是，本发明在上海生工合成目的序列xCas9，并通过同源臂重组克隆到目标载体pHSE401‑Cas9上，获得高效编辑载体pHSE401‑xCas9，其序列如SEQ ID NO.1所示。同时本发明在棉花原生质体和愈伤中验证载体pHSE401‑xCas9编辑效率，结果显示，本发明在棉花原生质体中验证pHSE401‑xCas9的编辑效率高于pHSE401‑Cas9；在棉花愈伤中验证pHSE401‑xCas9的编辑效率高于pHSE401‑Cas9。本发明在棉花中首次成功建立了CRISPR/xCas9基因编辑系统，该系统显示出较高的编辑效率，它将成为棉花功能基因组研究新的重要的技术手段。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及陆地棉基因组的高效编辑方法。

背景技术

CRISPR/Cas主要存在于古生物菌和细菌中，是细菌和古生物菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断迚化而来的一种获得性免疫防御机制。目前，CRISPR/Cas9系统是应用最多和最成熟的基因编辑系统，已广泛应用于动植物的细胞基因编辑，研究人员在应用过程中不断改进完善并展开了具有针对性的基因组编辑工作，创制目标突变体，进行基因功能的研究。

SpCas9核酸酶可以在多种细胞和生物体中进行有效的基因编辑，可以识别经典的5'-NGG-3'PAM序列，但是此PAM序列不管是在哺乳动物还是植物中都是有限的，所以这极大的限制了Cas9的目标选择范围。而Cas9的变体xCas9 3.6可以在哺乳动物细胞内识别5'-NG-3'、5'-GAA-3'和5'-GAT-3'三种模式的PAM序列，基因编辑范围至少提高了4倍。并且xCas9 3.6在哺乳动物细胞内检测出有较高的编辑效率和较低的脱靶效应。因此，xCas93.6不仅具有广泛的PAM序列兼容性，同时具有高度的DNA靶向特异性。

不同物种微生物的Cas核酸酶识别的PAM序列不同，如：金黄色酿脓葡萄球菌Cas9(Staphylococcus aureus Cas9,SaCas9)识别的PAM序列为5'-NNGRRT-3'、脑膜炎双球菌Cas9(Neisseria meningitidis Cas9,NmeCas9)识别的PAM序列为5'-NNNNGATT-3'、空肠弯曲杆菌Cas9(Campylobacter jejuni Cas9,CjCas9)识别的PAM序列为5'-NNNNACAC-3'、毛螺科菌Cpf1(Lachnospiraceae bacterium Cpf1,LbCpf1)和氨基酸球菌Cpf1(Acidaminococcus sp Cpf1,AsCpf1)识别的PAM序列为5'-TTTV-3'等，所以研究者们选择使用不同物种微生物的Cas9蛋白或者其它类型的效应蛋白用于基因编辑，避免因PAM序列的限制而不能对目标基因进行编辑。

发明内容

本发明的目的是提供一种陆地棉基因组的高效编辑方法，特别是构建一种适用于陆地棉的碱基编辑系统。本发明基于pCBC-DT1T2和pHSE401载体构建了融合xCas9核酸酶的适用于棉花遗传转化系统的碱基编辑系统。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种适用于陆地棉的基因编辑载体pHSE401-xCas9，所述载体pHSE401-xCas9的序列如SEQ ID NO.1所示。

一种适用于陆地棉的基因编辑载体pHSE401-xCas9的构建方法，获得目的序列xCas9，随后通过同源臂重组克隆到目标载体pHSE401-Cas9上，得到载体pHSE401-xCas9。

具体方法为：

(1)以pUC57-xCas9为模板，利用引物xCas-F/R进行TKS扩增，获得xCas9扩增片段；

(2)对载体pHSE401-Cas9进行双酶切，酶切位点采用XbaⅠ和SacI，得到pHSE401-Cas9酶切产物；