[发明专利]黑胫病菌胁迫下烟草miRNA靶基因预测及验证方法

权利要求书

1.黑胫病菌胁迫下烟草miRNA靶基因预测及验证方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)制备燕麦培养基；

(2)制备黑胫病生理小种孢子悬浮液；

(3)制备烟草茎部样品；

(4)检测黑胫病菌胁迫下烟草miRNA；

(5)构建小RNA测序文库，对测序文库中的数据进行统计，判断显著性差异，并运用OmicShare工具进行热图聚类分析；

(6)构建降解组文库，测序，并对测序数据进行分析；

(7)使用BLAST软件对潜在miRNA靶基因序列进行GO功能注释和代谢通路富集分析；

(8)根据small RNA高通量测序和生物信息学结果进行联合分析，筛选响应黑胫病菌胁迫的关键代谢通路，从中筛选重要病程相关的miRNA及靶基因，分别进行qRT-PCR技术验证。

2.根据权利要求1所述的黑胫病菌胁迫下烟草miRNA靶基因预测及验证方法，其特征在于：所述的燕麦培养基的组份按重量百分数计，包括：燕麦片30g，琼脂粉15g，去离子水1000ml。

3.根据权利要求1所述的黑胫病菌胁迫下烟草miRNA靶基因预测及验证方法，其特征在于：所述黑胫病生理小种孢子悬浮液采用以下步骤制备：

(1)将分离纯化的烟草黑胫病生理小种在燕麦培养基上培养21d，得到菌丝；

(2)用0.1％KNO₃和1％葡萄糖混合液浸泡所述菌丝，并放入26℃恒温箱培养72h，再将其置于8℃冰箱中处理20min取出，室温下10～30min有大量游动孢子释放，过滤，镜检，调整游动孢子的浓度为1×10³～1×10⁴个/ml。

4.根据权利要求1所述的黑胫病菌胁迫下烟草miRNA靶基因预测及验证方法，其特征在于：所述烟草茎部样品采用以下步骤处理获得：

(1)将烟草种子依次进行75％乙醇45s、5％次氯酸钠8min浸泡和无菌水冲洗处理；

(2)播种于育苗棚漂浮盘中，育苗基质采用高温高湿灭菌处理；

(3)待烟草长至8～10片真叶期时，转入昼夜温度分别为30℃和25℃、光暗时间比为12/8，湿度≥70％的人工气候箱中，适应性培养7d；

(4)采用人工茎基部注射接种黑胫病生理小种孢子悬浮液，每株接种5ml，取茎基部以上1cm组织样品1g，对所取样品进行无菌水清洗，然后灭菌纸檫干，迅速用液氮冷冻样品并将其放入-80℃超低温冰箱保存，完成烟草茎部样品的制备。