[发明专利]一种P450还原酶及其应用

权利要求书

1.一种P450还原酶，其特征在于，所述P450还原酶的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基础上发生如下突变中的至少一种：R967D、Q977E、Q1005E、W1047S。

2.根据权利要求1所述的P450还原酶，其特征在于，所述突变包括R967D、Q977E和W1047S；或

所述突变包括R967D、Q977E、Q1005E和W1047S；

优选地，所述P450还原酶具有如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

优选地，所述P450还原酶为非天然辅酶NCDH依赖型P450还原酶，所述非天然辅酶NCDH具有式I所示的结构：

优选地，所述非天然辅酶NCDH通过非天然辅酶NCDH再生酶利用再生底物还原非天然辅酶NCD而得；

所述非天然辅酶NCD具有式II所示的结构：

优选地，所述非天然辅酶NCDH再生酶包括苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/N213E、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R/I177K/N213I、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R/P176R/M207A、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R/P176E/M207A、甲酸脱氢酶FDH-V198I/C256I/P260S/E261P/S381N/S383F、甲醇脱氢酶MDH-Y171R/I196V/V237T/N240E/K241A中的至少一种；

所述再生底物包括苹果酸化合物、亚磷酸化合物、D-乳酸化合物、甲酸化合物、甲醇中的至少一种；

优选地，所述苹果酸化合物包括苹果酸和/或苹果酸盐；

所述D-乳酸化合物包括D-乳酸和/或D-乳酸盐；

所述亚磷酸化合物包括亚磷酸和/或亚磷酸盐；

所述甲酸化合物包括甲酸和/或甲酸盐。

3.一种如权利要求1～2任一项所述的P450还原酶作为K₃[Fe(CN)₆]还原酶、细胞色素c还原酶、噻唑蓝还原酶中的任一种的应用。

4.一种如权利要求1～2任一项所述的P450还原酶在P450酶催化底物转化中的应用。

5.一种融合酶，其特征在于，所述融合酶的氨基酸序列包含权利要求1～2任一项所述的P450还原酶的氨基酸序列和P450酶或P450酶结构域的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的融合酶，其特征在于，所述P450酶或P450酶结构域的氨基酸序列的C端与所述P450还原酶的氨基酸序列的N端通过连接肽连接；

优选地，所述连接肽具有如SEQ ID NO：12～16中任一所示的氨基酸序列；

优选地，所述P450酶选自Class I类的P450酶、Class II类的P450酶中的任一种；

所述P450酶结构域选自Class III类P450酶结构域中的任一种；

优选地，所述Class I类的P450酶为CYP101A1或CYP152L1；

优选地，所述Class II类的P450酶为CYP53A15；

优选地，所述Class III类P450酶结构域为CYP102A1的P450结构域；

优选地，所述P450酶或P450酶结构域的底物选自D-樟脑、C12-C18饱和脂肪酸、苯甲酸中的任一种。

7.一种酶催化体系，其特征在于，所述酶催化体系包括1～2任一项所述的P450还原酶、P450酶或P450酶结构域、非天然辅酶NCDH再生酶；或

包括权利要求5～6任一项所述的融合酶、非天然辅酶NCDH再生酶。

8.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～2任一项所述的P450还原酶、权利要求5～6任一项所述的融合酶中的任一种。

9.一种载体，其特征在于，所述载体包含含有权利要求8所述的核酸的表达盒。