[发明专利]一株氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

一株氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.19179。本发明先合成氯吡脲半抗原和完全抗原，再使用弗氏佐剂混合乳化，注射免疫BALB/c小鼠。筛选出高效价，低IC₅₀的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并五次亚克隆，最终得到单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对氯吡脲具有较好的检测灵敏度，可用于制备氯吡脲的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，用于食品中氯吡脲的残留检测。

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，具体涉及一株氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

氯吡脲的英文通用名为：Forchlorfenuron，化学名称：1-(2-氯-4-吡啶)-3-苯基脲；氯吡脲属苯脲类细胞分裂素，其生理作用主要有：1)促进细胞分裂，扩大细胞体积；2)促进器官形成和蛋白质的合成；3)增强抗逆性、延缓衰老；4)打破顶芽优势；5)诱导休眠芽的形成；6)促进坐果、果实膨大；7)提高光合作用效率；8)诱导单性结实。其生理作用与一般嘌呤型细胞分裂素类似，但作用质量浓度更低，活性更高。它在质量浓度高时还可用作除草剂。

氯吡脲作为一种新型高效植物生长调节剂，其生长促进作用效果优异，被广泛应用于果树、蔬菜、粮食作物等，我国已在猕猴桃、甜瓜等作物上获得登记，目前其使用范围还有进一步扩大的趋势。但人体摄入量过多必然危害健康，长期接触氯吡脲会引起体内蛋白质代谢的紊乱、轻度的肺气肿和体形消瘦。

目前，氯吡脲检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析氯吡脲残留物的方法。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测氯吡脲的前提是得到对氯吡脲具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对氯吡脲具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。

发明内容

本发明的目的首先是提供一种氯吡脲单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2019年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为单克隆细胞株ABC08，保藏编号CGMCC No.19179，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。此杂交瘤细胞株分泌的氯吡脲单克隆抗体对氯吡脲具有较好的检测灵敏度(IC₅₀值为0.39ng/mL)，可以用于建立氯吡脲的免疫学检测方法，检测食品中氯吡脲的残留。

本发明的第二个目的是提供了一种制备上述氯吡脲免疫原的方法，包括以下步骤：

(1)合成氯吡脲半抗原：

a)将氯吡脲溶于DMSO，再加入KOH，得到混合溶液a；

b)将β-巯基丙酸溶于DMSO并转移至恒压滴定装置中，在搅拌下将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到混合溶液a中，油浴加热，缓慢升温至100℃，保温2h后，撤去油浴，自然冷却至室温，得到混合溶液b；

c)向混合溶液b中加入水，用HCl溶液调节pH值为3～4，将此混合液转移到分液装置中，用二氯甲烷提取，收集有机相；

d)用NaHCO₃水溶液洗涤二氯甲烷提取液，收集水相；用少量乙醚洗涤水相，弃去乙醚层；再用HCl溶液调节水相pH值为3～4，然后用乙酸乙酯萃取水相，合并乙酸乙酯提取液；用少量蒸馏水洗涤乙酸乙酯，弃水层；