[发明专利]一种CSFV的IFA中和抗体检测方法

说明书

本发明公开了一种CSFV的IFA中和抗体检测方法，属于生物技术领域。本发明公开的一种CSFV的IFA中和抗体检测方法，细胞反应板可提前制备，可在‑20℃长期保存；反应结果可用荧光显微镜进行观察。IFA检测具有特异性强、敏感性高、操作简单的特点；且IFA方法利用活病毒接种，使用的是全病毒，抗原结构更加完整，结果更具有准确性和代表性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种CSFV的IFA中和抗体检测方法。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever)，早期称猪霍乱(Hog Cholera,HC)，是由猪瘟病毒(Classical Swine FeverVirus,CSFV)引起猪的一种急性、热性和高度接触性传染病，其特征为高热稽留和全身广泛性出血。猪瘟的发病率和死亡率都很高，主要分为急性型、亚急性型、慢性型、非典型猪瘟或温和型猪瘟，给全世界养猪产业造成巨大的经济损失。其在世界各地均有不同程度的流行，我国将此病列为一类动物疾病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病。猪瘟病毒(CSFV)属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，是RNA病毒，具有感染性。在自然条件下，猪还可能感染与猪瘟病毒(CSFV)同属的牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)和绵羊边界病病毒(Borderdisease Virus，BDV)，但是CSFV却只对猪有致病性。虽然CSFV对其他动物没有致病性，但是它可以在小鼠、牛和山羊等动物体内进行增殖。目前，猪瘟防治的主要措施是疫苗免疫，我国学者周泰冲等研究的C株猪瘟兔化弱毒疫苗、法国的Thiverval株弱毒疫苗和日本的细胞弱毒疫苗等弱毒疫苗成功问世，并在猪瘟防治中起着重要作用。现在我国使用的疫苗主要有猪瘟兔化弱毒疫苗，脾淋苗及牛睾丸疫苗。这些疫苗已经能够很好的控制猪瘟的流行，但是由于疫苗的长期使用，致使猪瘟在流行上发生了较大的改变，主要变为非典型性猪瘟和温和性猪瘟。这造成了猪瘟诊断及防治的困难，也使得猪瘟一直流行，困扰着中国养猪业。基于此，建立快速准确的诊断方法和研究其感染机制对CSFV的综合防控具有重要意义。

因此，提供一种CSFV的IFA中和抗体检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种CSFV的IFA(间接免疫荧光)中和抗体检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种CSFV的IFA中和抗体检测方法，具体步骤如下：

(1)将PK15细胞消化离心后制备成含1.0×10⁵cells/mL的细胞悬液，每孔100μL铺到96孔板上，置于37℃5％CO₂培养箱中培养12h，待细胞完全贴壁，将等体积的CSFV病毒液和临床血清37℃孵育1h，然后接种到96孔板内的PK15细胞上，培养48h待细胞长满后取出96孔板；同时设立正常接毒细胞对照孔；

(2)用预冷的无水乙醇固定，加入预冷的无水乙醇，每孔50μL，-20℃放置30min；弃去无水乙醇，PBST清洗，拍干；

(3)加入5％的脱脂奶粉进行封闭，每孔200μL，37℃温箱放置2h；PBST清洗，拍干；

(4)加入CSFV阳性抗体，用PBS按照1:400稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放置1h；PBST清洗，拍干；

(5)加入羊抗猪IgG-FITC，用PBS按照1:100稀释，每孔加入50μL，37℃温箱放置1h，PBST清洗；最后每孔加入PBST 50μL，在倒置荧光显微镜进行观察。

进一步，所述CSFV病毒液的制备方法如下：将临床采集的病料组织进行研磨，按照1mg组织样品加入1mL PBS溶解，反复冻融3次，取上清；12000rpm离心5min，用0.22μm滤器过滤，获得CSFV病毒液。