[发明专利]一种芽孢杆菌属绝对定量的探针、方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种芽孢杆菌属绝对定量的探针、方法、试剂盒及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。本发明的芽孢杆菌属微生物定量探针和试剂盒，能够实现所有芽孢杆菌微生物的总量检测，用于检测和芽孢杆菌微生物定量时不需要使用昂贵仪器，可在2.5h内快速完成定量工作。同时，本发明所使用的样品不必须进行核酸提取。基于本发明的探针、检测试剂盒用于芽孢杆菌属微生物定量，具有快速、方便、便宜、准确的特点。

技术领域

本发明涉及一种芽孢杆菌属微生物绝对定量方法、试剂盒及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。

背景技术

芽孢杆菌(Bacillus)广泛分布在传统发酵食品酿造系统中，参与发酵过程的多种底物的代谢和产物和合成，例如大分子蛋白的降解、多糖的降解以及吡嗪类化合物的合成等。因此，芽孢杆菌微生物的规律性演替是稳定食品质量的基本保证。目前，芽孢杆菌的定量主要为荧光定量PCR法，依靠荧光定量PCR仪，但价格昂贵、操作过程较为复杂。为实时跟踪芽孢杆菌再发酵过程中的动态变化规律，促进产品的稳定和升级，非常有必要提供一种简便、快速、准确的定量方法。

G四链体/血红素模拟酶活检测的原理在于G四链体可以与血红素形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，可催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+，呈现绿色的显色反应，可在波长420nm下检测特征吸光值。G四链体结构的稳定性对整个检测过程至关重要，如果设计不当，当G四链体序列与其他碱基形成二聚体时，会导致G四链体序列无法形成G四链体，以此原理为基础的定量方法在使用中会导致低估样本中目标基因的含量，降低检测方法的灵敏度和准确性。

目前，基于G四链体/血红素模拟酶活检测的原理有被用于微生物的特异性检测的报道；例如文献Wang Y,Li X,Xi D,Wang X.Visual detection of Fusariumproliferatum based on asymmetric recombinase polymerase amplification andhemin/G-quadruplex DNAzyme.Rsc Advances 2019；9:37144-37147.中，使用了不对称特异性引物(上游引物添加G四链体的反向序列修饰，下游不修饰)，该方法只能适用于样本中特定细菌Fusarium proliferatum的检测，无法实现所有芽孢杆菌微生物的总量检测；此外，该文献利用该不对称特异性引物进行检测时，是在PCR体系中添加不同浓度的上下游引物(上游引物浓度低，下游引物浓度高)，通过重组聚合酶扩增(RPA)扩增形成双链产物，随着PCR反应的进行，上游引物被消耗殆尽，下游引物使用新合成的双链DNA为模板扩增，从而形成带有G四链体末端的单链DNA，从而使用G四链体/血红素模拟酶活检测检测样本中的Fusarium proliferatum。但该定量方法依然需要PCR步骤产生G四链体，而PCR过程依然需要高额PCR设备以及严格的操作环境。

发明内容

本发明的一种用于芽孢杆菌微生物绝对定量的方法、试剂盒及应用，解决了如下的至少一个技术问题：(1)现有的方法无法实现所有芽孢杆菌微生物的总量检测；(2)现有定量方法在物种分辨率较低和/或检测准确性不足；(3)现有定量方法需要高额的仪器设备和/或严格的操作环境，不适用于生产采样后的及时检测；(4)现有定量方法操作繁琐等。

本发明的第一个目的是提供一组探针，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列为SEQ ID NO.1所示(GGGTGGGTGGGTGGGTAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT)或SEQ ID NO.3所示(GGGATTGGGATTGGGATTGGGAAAGCTGATTTGAAAGTCATTGGAGAT)。

在一种实施方式中，淬灭探针序列为SEQ ID NO.2所示(ATCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTACCCA)或SEQ ID NO.4所示(ATCTCCAATGACTTTCAAATCAGCTTTCCCAA)。