[发明专利]一种产类胡萝卜素的酵母突变菌株及其突变位点应用

说明书

本发明公开了一种产类胡萝卜素的酵母突变菌株及其突变位点应用。酿酒酵母M3保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:61336。本发明通过乙醇介导的实验室适应性进化筛选获得一株酿酒酵母突变菌株M3。该菌株在摇瓶发酵条件下，YPD培养基中类胡萝卜素含量可以达到19.7mg/g，比出发菌株提高5.1倍；而在YPM培养基中类胡萝卜素含量可以达到42.4mg/g细胞干重。经基因组测序及反向代谢工程研究，确定PFK1基因失活是类胡萝卜素积累提高的主要因素，为定向改造提供了新的靶点。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种产类胡萝卜素的酵母突变菌株及其突变位点应用。

背景技术

类胡萝卜素是一大类有颜色的类异戊二烯物质，由于其具有超强的抗氧化性，可以用于着色剂、营养品、抗氧化剂等。当前，化学合成和天然提取是制备类胡萝卜素的主要方式。由于结构的复杂性和原料供应不稳定、有机溶剂污染、得率低等因素限制了类胡萝卜素的规模化生产。野生型酿酒酵母并不能合成类胡萝卜素，但是通过基因工程改造酿酒酵母用于类胡萝卜素合成已经取得了长足的进步。但是，要在已有报道的基础上，发现新的基因改造靶点，进一步提高类胡萝卜素的合成还是很困难的。而自然诱变或者定向进化为寻找新靶点提供了可能。例如，通过常温等离子诱变(ARTP)可以将虾青素的产量提高0.83倍，并揭示了3个潜在的靶点。另外，ARTP结合过氧化氢介导的实验室适应性进化可以将虾青素含量提高4倍，但并未揭示相关潜在基因。

实验室适应性进化(ALE)是一种经过长期驯化，不断适应筛选压力进而累积有益突变的一种技术。在代谢工程研究中，ALE可以发现新的改造靶点，并获得高产菌株。ALE 可以提高菌株生长速率、提高产物产量、利用非天然底物、提高对环境胁迫的抗性等。并且可以通过基因组测序，揭示表型性状与基因改变的关系。例如，在重组酿酒酵母中，通过过氧化氢介导的适应性进化显著提高了类胡萝卜素的合成，并揭示了相关突变。相比较紫外诱变等诱变形式，ALE突变率较低，更容易揭示潜在的突变基因。

ALE往往需要选择合适的筛选压力来驱动定向进化。根据已知的酿酒酵母乙醇耐受性机理，可以通过改变细胞膜结构来增加酿酒酵母对乙醇的耐受性，而同样也可以通过改变细胞膜结构来增加类胡萝卜素的积累。所以，我们推测可以利用乙醇作为筛选压力，来驱动细胞膜结构的改变，从而筛选到利于类胡萝卜素积累的突变。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产类胡萝卜素的酿酒酵母变菌株-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)M3，其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：GDMCC No:61336。

本发明人以申请人已申请专利(申请号为：2019103999462)中酿酒酵母BL03，Cit1- tHMG1，ΔAld6菌株为出发菌株，通过乙醇介导的实验室适应性进化获得类胡萝卜素含量明显提升的酿酒酵母变菌株，并确定了PFK1基因的缺失是促进作用的主要来源，为类胡萝卜素合成提供了新的改造靶点。

本发明的第二个目的是提供上述酿酒酵母M3在类胡萝卜素生产中的应用。

优选是将酿酒酵母M3接种到YPD或YPM培养基中进行发酵培养，产类胡萝卜素。

本发明的第三个目的是提供一种提高酿酒酵母类胡萝卜素产量的方法，其是将酿酒酵母基因组中的PFK1基因突变失活。

优选是将酿酒酵母基因组中的PFK1基因突变失活的突变株接种到YPD或YPM培养基中进行发酵培养，产类胡萝卜素。

本发明的第四个目的是提供将酿酒酵母基因组中的PFK1基因突变失活在提高酿酒酵母产类胡萝卜素中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种突变菌株，是将酿酒酵母基因组中的PFK1基因突变失活获得的菌株。