[发明专利]一种利用水稻内源序列抑制HSL1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用

说明书

本发明涉及一种利用水稻内源序列抑制HSL1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用，以及一种干扰植物HSL1(HIS1‑Like)基因表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将本发明的RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制基因HSL1的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，使得转基因植株可以通过施用除草剂被清除，从而培育了一种除草剂显性敏感的水稻。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种利用水稻内源序列类似HPPD抑制剂敏感型1基因HSL1(HIS1-Like基因)的植物干扰表达载体和其构建方法及应用。

背景技术

转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛。然而转基因产品自诞生之日起产生的争议，至今仍甚嚣尘上。因此，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系是解决问题的有效手段之一。

β-三酮类除草剂(b-Triketone herbicides,bTHs)是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂，广泛应用于农业，可有效地防除多种阔叶杂草和禾本科杂草。呋喃磺草酮(Tefuryltrione,TFT)属三酮类除草剂之一，可抑制植物生长中不可或缺的色素合成，通过根、茎、幼芽、叶吸收并迅速传导，HPPD是目前最重要的除草剂作用靶标之一。HPPD抑制剂类除草剂是通过抑制植物体内生育酚及质体醌合成，导致类胡萝卜素生物合成受阻，最终使植物体内叶绿素破坏，导致叶片发白，最终枯萎死亡。HPPD抑制剂类除草剂作用机理独特，与当前市场主流药剂不存在交互抗性，所以可有效解决当前抗性恶性杂草问题。呋喃磺草酮是我国目前水稻田已获登记的四个HPPD抑制剂中对水稻最安全的HPPD抑制剂类除草剂。呋喃磺草酮通过杂草根、茎、幼芽和叶片均可吸收，可同时防控禾本科杂草和阔莎草。

水稻有6个HIS1-like基因(HSL)，且高度保守。5个HSL(1/2/4/5/6)位于Chr6以基因簇的方式存在。HSL所编码蛋白具有双链β螺旋折叠，是Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型加氧酶蛋白的典型结构特征。进化分析表明，植物中的HSL基因可能拥有相似的功能。而研究表明，水稻OsHSL1具有对呋喃磺草酮TFT等β-三酮类除草剂的抗性。

因此，开发出一种能够有效显性抑制HSL1基因表达的技术手段，可为杂交水稻制种、培育转基因新品种、防止转基因逃逸等方面提供有效管控方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效的影响HSL1(HIS1-Like)基因表达的植物表达载体及其构建方法。

为达到以上目的，本发明第一方面提供一种抑制HSL1(HIS1-Like)基因表达的RNAi植物表达载体，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。

SEQ ID No.1所示的DNA片段为基于HSL1编码框的正向DNA片段，长度为220bp；SEQID No.3所示的DNA片段基于HSL1编码框且与SEQ ID No.1所示的DNA片段反向互补，长度为220bp；SEQ ID No.2为来自水稻Zinc finger基因的内含子序列(Rice intron)。

SEQ ID No.1-3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发夹表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成发卡的“环”，SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。

发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。