[发明专利]一种利用活体生测体系筛选烟草青枯病生防菌的方法

权利要求书

1.一种利用活体生测体系筛选烟草青枯病生防菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：生测初筛，

(1)以感病烟草品种红花大金元为生测对象，漂浮育苗培育烟苗至4～5叶期，并将生测对象分为试验组和对照组，每组2株烟苗；

(2)首先对烟苗根部造伤，然后将试验组接种培养48h的候选生防菌1mL，以接种LB液体培养基的烟苗设为对照组，将漂浮盘置于恒温人工气候室培育1～2d，对试验组和对照组挑战接种烟草青枯菌，在恒温人工气候室继续培养；

(3)观察试验组和对照组发病情况，当对照组发病率＞80％时，记录实验组烟株发病情况，筛选有控病能力的生防菌；

步骤S2：生测复筛，

(1)将生测初筛获得的生防菌再次进行生测复筛选，复筛选时处理组和对照组分别处理8～16株烟苗，烟苗根部造伤、生防菌接种、烟草青枯菌的接种方法同步骤S1；

(2)分别于接种青枯菌后10d和20d调查各处理烟苗的病害等级，计算病情指数，筛选有防效的生防菌用于温室盆栽验证防效；

步骤S3：温室验证，

(1)生防菌的温室防效评价于温控28～30℃温室大棚进行，试验设置青枯菌处理组、对照组，每处理3次重复，每重复10株烟株；

(2)生防菌用LB培养液培养，在225r/min 30℃摇培48h；病原青枯菌用CG液体培养基培养，在225r/min 30℃摇培24h；

(3)将红壤与有机质按3:1混匀后移栽烟苗，烟苗为二次剪叶的烟苗，约培育50d，移栽后将250mL生防菌发酵液稀释25倍后灌根处理试验组，并以等体积LB稀释液处理对照组；次日每株烟挑战接种烟草青枯菌100倍稀释液；接种后每7d调查一次病情指数，连续调查5次；

(4)根据调查结果进行统计；计算发病率、病情指数和防效。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述漂浮盘规格为8×14、9×18孔漂浮盘。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述LB液体培养基包含1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖；所述CG培养基包含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生防菌和青枯菌接种顺序为先用无菌刀片在烟苗根部两侧形成创伤后，用生防菌预处理烟苗根部，1～2d后再接种病原菌，或生防菌和病原菌同时灌根烟苗。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S1和S2中烟草青枯菌的接种量为1.0mL×10⁷～1.0mL×10⁹CFU/mL，生防菌的接种量为1.0mL×10⁸～1.0mL×10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中烟草青枯菌的接种量为50mL×10⁷～50mL×10⁸CFU/mL，生防菌的接种量为200mL×10⁷～200mL×10⁸CFU/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述恒温人工气候室温度设置为28～30℃。

8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于：所述发病率＝发病植株/调查植株总数×100％。

9.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于：所述病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/调查总株数×最高级代表值；

其中，烟株发病程度按病害等级划分为0、1、3、5、7和9级。

10.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于：所述防效＝100×(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数。