[发明专利]一种碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1及其构建和应用

说明书

本发明提供了一种碱基编辑器SpCas9‑LjCDAL1及其构建和应用。本发明设计合成了新的类胞嘧啶脱氨酶LjCDAL1基因，融合失活的nSpCas9基因及3个重复的尿嘧啶糖基化酶基因抑制剂基因(uracil DNA glycosylase(UDG)inhibitor，eUGI)，成为SpCas9‑LjCDAL1基因。并且本发明还提供包含该SpCas9‑LjCDAL1基因的表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用设计的SpCas9‑LjCDAL1基因构建植物表达载体，进而构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的单碱基替换，特别是实现由C/G碱基突变成T/A。

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

目前的基因编辑技术(ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9)依赖于在靶位点诱导双链断裂，进而激活DNA修复机制，实现基因矫正的目的。因此，基于双链断裂的基因编辑技术不仅容易产生DNA片段插入和缺失，且可能会产生脱靶效应及不确定编辑的产生，最终影响靶基因的功能。而单碱基编辑技术的出现能够实现更精准的基因替换。

单碱基基因编辑技术(base editors，BEs)，指能在基因组上引起单个碱基改变的基因编辑技术。基本原理是将胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)或腺苷脱氨酶与Cas9n(D10A)融合而形成，依赖于CRISPR原理使得靶点远离PAM端的4-7位的单个碱基发生修改的基因编辑技术。目前的单碱基基因编辑包括两种，一种是CBEs(Cytidine base editors)——嘧啶碱基转换技术(C/G到T/A)，另一种是ABEs(Adenine base editors)——嘌呤碱基转换技术(A/T到G/C)。

基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，2016年4月，哈佛大学生物化学家David Liu组率先在《自然》杂志上报告了一种新的基因编辑工具——单碱基编辑系统。单碱基编辑系统主要由sgRNA和融合蛋白两部分组成，其中融合蛋白一般由改造的Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成，而常兴组的融合蛋白仅包含Cas9和胞嘧啶脱氨酶两部分。sgRNA通过与靶位点互补配对，引导融合蛋白结合到靶位点发挥作用。融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶能够使非互补链中相应的胞嘧啶C经脱氨基作用转变为尿嘧啶U，而DNA复制进一步使得U被T代替，而互补链上原来与C的互补碱基鸟嘌呤G将会变成腺嘌呤A，而尿嘧啶糖基化酶抑制子则能够抑制U的切除，最终实现非互补链上的C替换为T和互补链上G替换为A的精确编辑。

转基因技术在改良作物性状方面已经做了大量的工作，但由于外源基因的导入和公众科普的缺乏，使得转基因作物的推广和应用存在较大的难度。作物在漫长的人工选育过程中，人类通过人工选择的方式定向选育具有优良性状的基因突变株，但该过程耗时、耗力且不可控。利用同源重组技术，可以获得定点修饰的优良植物株，但由于同源重组的效率太低，因此可行性不高。单碱基编辑技术在人细胞中高效编辑单个碱基的结果，提示可以通过该系统在农作物中的进行定点可控的基因编辑，进而快速、高效地获得优良性状的植株。但目前使用的单碱基编辑系统仍然存在一定的缺陷，如在植物中的编辑效率不稳定，编辑窗口有限等。为了优化编辑效率和扩展编辑窗口，挖掘和利用其它类型的胞嘧啶脱氨酶和类胞嘧啶脱氨酶实现更高效和更宽窗口的碱基编辑。因此，本发明希望提供一种新型的高编辑效率的工具，在实现更高编辑效率和更宽编辑窗口的同时，仍然保持了其基因编辑精准性。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种碱基编辑工具SpCas9-LjCDAL1，实现由C/G到T/A的精准高效和宽窗口的碱基替换。