[发明专利]一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法

说明书

本发明属于生物工程质检技术领域，具体涉及一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，分别配制两种RT‑qPCR反应体系，分别扩增细菌16S的rRNA和人ACTB，经过RT‑qPCR反应后，根据扩增后的细菌16S的rRNA的CT值和人ACTB的CT值的差值ΔCT=CT_(ACTB)‑CT_(16S)，比较ΔCT与阈值的关系：若高于阈值，则生物组织样本为阳性，质控不合格；若低于阈值，则生物组织样本为阴性，质控合格。本发明方法在阈值取4时，质控结果具有最佳的灵敏度（86.7%）和特异性（93.8%），且检测方便、耗时短、准确度高。

技术领域

本发明属于生物工程质检技术领域，具体涉及一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法。

背景技术

随着生物技术的发展，临床治疗选择更广泛，除了传统的放射治疗、化学药物治疗和手术治疗，近年来靶向药物治疗和免疫治疗取得了巨大的进步，而靶向治疗和免疫治疗的针对性很强，每种药物都有特异的作用位点，患者只有携带特定的变异位点才能选择相应的药物进行治疗，这就要求患者在选择药物前需要进行基因检测才能更好地进行用药。

临床用药指导进行基因检测中很多项目只检测DNA，但是DNA并不完全包含药物治疗靶点，比如基因融合、基因结构变异和基因表达水平等并不能通过DNA序列得到，而RNA是重要的遗传物质，基因中编码的信息被转录成RNA分子，而RNA分子又可以翻译成蛋白质或直接用于精细控制基因表达。因此，以一定条件和时间转录的RNA反映了细胞的当前状态，并可以揭示疾病的病理机制，而且RNA在科研活动中也有着广泛的应用。

临床上进行检测的样本来源主要是福尔马林固定的石蜡包埋（Formalin-Fixedand Parrffin-Embedded，FFPE）的组织样本，因此，进行用药指导的基因检测必须首先从FFPE样本中提取RNA，然后进行RNA测序得到需要的基因信息，所以，FFPE的质量决定了最终能够得到的信息的准确性。

细菌体积小、形状多样、种类繁多、繁殖快、生命力顽强，在基础研究和临床试验中危害极大。FFPE样本在取样和保存过程中如果没有严格按照标准操作规程操作容易滋生细菌，细菌污染会导致从FFPE样本中提取的核酸不完全是人类基因还包括细菌基因，而且细菌滋生还会使FFPE中人类基因严重降解，这都会影响得到的基因质量，进而影响检测结果的准确性。所以从FFPE样本中检测细菌污染对于RNA测序是很重要的一个质控。

目前临床应用中对于FFPE样本提取核酸是否有细菌污染并不重视，急需一种简便快捷的方法作为整个流程的质控，来避免有细菌污染的核酸进入下一环节继续实验影响最终结果的准确性。随着PCR、基因测序等技术的不断进步，细菌检测由最初的表型和化学鉴定演变成分子水平的研究。荧光定量PCR（RT-qPCR）方法因其特异性好、速度快、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为分子生物学研究中的重要工具。

目前的细菌检测只扩增细菌16S rRNA保守区序列，指标单一，不能很好的反映FFPE样本中提取的RNA质量，而人的管家基因（人ACTB）高度保守而且表达水平受环境因素影响较小，可以反映人基因状态。

因此，本发明提出一种通过检测FFPE样本中提取的RNA中细菌16S rRNA和人ACTB，能够更好地体现RNA质量，有利于RNA的后续研究及应用。

发明内容

为了解决现有技术中检测FFPE组织样本中细菌方法存在的检测指标单一、检测结果的准确度不高、特异性差、耗时长等问题，本发明在于提供一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，利用RT-qPCR反应，通过扩增细菌16S rRNA部分保守区序列和人ACTB检测细菌污染的方法，将细菌污染程度与ΔCT相关联，具有高的灵敏度和特异性、耗时短的优点。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，包括如下步骤：