[发明专利]特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用

说明书

本发明公开了特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用，本发明以大口黑鲈病毒为靶标，利用GO‑SELEX技术获得了能与大口黑鲈蛙病毒高亲和力，高特异性结合的寡核苷酸适配体，能够快速、灵敏、特异的检测到大口黑鲈蛙病毒。适配体成本低，稳定性好，易于修饰，可作为抗体分子的前景性替代分子，被应用于生命科学各个领域的研究工作中。本发明还提供一种微生物分子生物学检测方法：基于核酸适配体技术快速、准确检测大口黑鲈蛙病毒的方法，为后续生物传感器的构建及实际样品中大口黑鲈蛙病毒的检测提供参考。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides)，俗称加州鲈、大嘴鲈，在鱼类分类学上隶属于鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Porcoidei)、太阳鱼科(Cehtrachidae)、黑鲈属(Micropterus)，属广温性淡水名优鱼类，主要分布于北美的加利福尼亚州密西西比河水系。因其具有适应性较强、个体较大、生长迅速、容易捕获、养殖周期短等优点，且肉多味美，刺少无硬骨，外形美观，大口黑鲈已成为我国重要的淡水养殖品种，颇受养殖者和消费者欢迎。作为一种全球养殖鱼类，其2018年产量超过43.5万吨，其中中国占99.2％。

大口黑鲈病毒(LMBV)属于虹彩病毒科蛙病毒属，由该病毒引起的溃疡综合征病发病急、死亡率较高，给养殖者造成的损伤较大，已成为大口黑鲈养殖产业的严重威胁。该病可造成大口黑鲈皮肤、肌肉和鱼鳍红肿溃烂,鳃丝和肝脏发白，脾脏和肾脏肿大出血。由于其发病症状与嗜水气单胞菌(细菌)和镰刀菌(真菌)相似，均可引起大口黑鲈皮肤溃烂，在实际生产中，还常常出现养殖户或技术服务人员“误诊”的情况，造成病害大爆发。因此，在发病初期，及早发现病原体并采取相应的措施防治，对减少病害的发生尤为重要。

随着分子生物学相关学科的迅速发展，越来越多的分子检测技术已应用于病原微生物的检测。针对大口黑鲈病毒属虹彩病毒，已有普通PCR、多重PCR及荧光定量PCR检测方法的报道。虽然这些分子诊断技术具有一定的敏感性，特异性也较强，并且可大批量检测及避免主观偏差等优点，部分解决了快速检测的需求，但由于试验过程需要专业技术人员及PCR基因扩增仪、杂交仪等昂贵的仪器设备而造成一定的局限性；免疫学方法具有灵敏度高、特异性强、易于观察等优点，但抗体制备所需时间长，成本高，不稳定。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体及其筛选方法与应用。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体，所述寡核苷酸适配体的核苷酸序列为：

LVA-3 5'-CGACGAAATGTGACGTGACTGTGGTAGTACATGCTTGCCC-3'

LVA-5 5'-ACAGTGATGCGTAGTTCCGTGCGCTGAGTGGTGTTCGTGA-3'

LVA-12：5'-CAGCGTGAGCGGACGGGGCTGCGTTCAGTGCCGCGATGCC-3'。

一种特异性识别大口黑鲈病毒的寡核苷酸适配体的筛选方法，所述寡核苷酸适配体为以上所述的寡核苷酸适配体，包括以下步骤：

(1)随机单链DNA文库的建立和引物

随机单链DNA文库：5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC(N 40)CGATATCTCGGAGATCTTGC-3′，两端为固定序列，中间N40为含40个碱基的随机序列；

引物F：5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC-3′

引物R：5′-GCAAGATCTCCGAGATATCG-3′