[发明专利]副溶血弧菌和细菌总数快速同步多重检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种快速同步多重检测样品中副溶血弧菌和细菌总数的方法，其特征如下：

1)区分样品中的细菌和其它背景颗粒：使用可以标记全部细菌的红色荧光探针对细菌总数进行标记；

2)区分样品中的副溶血弧菌和非副溶血弧菌：使用绿色荧光探针通过化学基团交联的副溶血弧菌抗体，特异性标记样品中的副溶血弧菌；

3)通过流式分析仪同时计数1)和2)产生的红色和绿色荧光信号，实现副溶血弧菌和细菌总数的同步定量检测。

上述2)中，所述副溶血弧菌抗体是用免疫原为4个副溶血弧菌特异性外膜蛋白的混合物制备的，所述4个外膜蛋白分别为OmpU，OmpK，OmpC及OmpA；

上述3)中，副溶血弧菌和细菌总数的判定方法如下：对于一个颗粒产生的事件，如果仅检测到红色荧光，则判定为细菌，但不是副溶血弧菌；如果同时检测到红色和绿色两种荧光，则判定为副溶血弧菌；如果未检测到荧光，则判定为非细菌的杂质颗粒。

2.权利要求1所述的方法，所述副溶血弧菌抗体还具有以下技术指标：

a所述抗体可以在流动相内与副溶血弧菌发生反应；

b所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对副溶血弧菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；

c所述抗体与副溶血弧菌特异性菌体蛋白的亲和力KD应小于2×10^-10；

d所述抗体能够识别所有的副溶血弧菌菌株。

3.权利要求1所述的方法，所述通过流式分析仪计数，是通过流式分析仪的散射光通道进行圈门，并通过双荧光通道检测所述红色和绿色荧光信号，从而计数副溶血弧菌和细菌总数；其中，前向角散射光通道的圈门在500nm到2500nm之间。

4.权利要求3所述的方法，所述圈门，其方法为：使用流式分析仪测量500nm标准微球和2500nm标准微球，在前向角散射光通道的直方图上，根据微球的信号位置进行圈门，下限在500nm，上限在2500nm。

5.权利要求1所述的方法，所述红色荧光探针的荧光发射光谱在601nm～640nm；所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。

6.权利要求1所述的方法，所述流式分析仪的技术指标和检测参数是：荧光灵敏度10MESF，散射光灵敏度50nm，荧光分辨率RSD3％，散射光分辨率3％；分析速度为1～30μL/min，检测时间为15～300s。

7.权利要求1～6任一所述的方法，待检样品进行检测之前需要进行纯化处理；所述纯化，方法是将待测样品加入水中悬液，然后过滤收集滤液，将滤液离心并弃去上层液体，保留底部的沉淀，然后加入PBS重悬，得到纯化的样品菌悬液。

8.一种用于同步多重检测样品中副溶血弧菌和细菌总数的副溶血弧菌抗体，是用免疫原为4个副溶血弧菌特异性外膜蛋白的混合物制备的，所述4个外膜蛋白分别为OmpU，OmpK，OmpC及OmpA；

所述副溶血弧菌抗体还具有以下技术指标：

a所述抗体可以在流动相内与副溶血弧菌发生反应；

b所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对副溶血弧菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；

c所述抗体与副溶血弧菌特异性菌体蛋白的亲和力KD应小于2×10^-10；

d所述抗体能够识别所有的副溶血弧菌菌株。