[发明专利]山药不同组织荧光定量的内参基因及其引物与应用有效
| 申请号： | 202011469612.7 | 申请日： | 2020-12-14 |
| 公开（公告）号： | CN112575010B | 公开（公告）日： | 2022-11-08 |
| 发明（设计）人： | 龙雯虹;孙一丁;唐文芳;王仕玉;段延碧;徐升胜;尹冬 | 申请（专利权）人： | 云南农业大学;云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 |
| 主分类号： | C12N15/54 | 分类号： | C12N15/54;C12Q1/6809;C12Q1/6895;C12N15/11;G16B20/00;G16B30/00 |
| 代理公司： | 昆明正原专利商标代理有限公司 53100 | 代理人： | 金耀生;于洪 |
| 地址： | 650201*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 山药 不同 组织 荧光 定量 内参 基因 及其 引物 应用 | ||
1.一种山药不同组织荧光定量的内参基因，其特征在于，所述内参基因CKI-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种山药不同组织荧光定量的内参基因，其特征在于，上游引物如SEQ ID NO.2所示；下游引物如SEQ ID NO.3所示。
3.权利要求1所述的山药不同组织荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从候选内参基因中，选择E值接近零或者为零的12个基因序列；
S2、对步骤S1筛选的12个基因进行引物设计，并利用引物进行PCR扩增，验证引物的特异性；
S3、提取山药的茎尖、叶片、根和花束的总RNA，反转录合成第一链cDNA，采用S2设计的引物进行实时荧光定量PCR分析，计算Ct值，对步骤S1筛选的12个基因的表达稳定性进行分析；
S4、综合确定最稳定表达的山药不同组织荧光定量的内参基因。
4.根据权利要求3所述的山药不同组织荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，在步骤S2中，PCR反应体系为20μL：包括17.0μL Green Mix，1.0μL cDNA，1.0μL 10μmol/L上游引物，1.0μL 10μmol/L下游引物；
反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，退火温度60℃ 30s 及延伸温度72℃10s，循环30次。
5.根据权利要求3所述的山药不同组织荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，在步骤S3中，实时荧光定量PCR反应体系为20μL：包括10.0μL qPCR Master Mix SYBRGreen Ⅰ，1.0μL cDNA，0.8μL 10 μmol/L上游引物，0.8μL 10 μmol/L下游引物，ROX 0.4μL，ddH2O 7.0μL；
反应条件：95℃预变性1min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，循环40次。
6.根据权利要求3所述的山药不同组织荧光定量的内参基因的筛选方法，其特征在于，在步骤S4中，利用Delta CT、geNorm、Normfinder、BestKeeper和Comparative △Ct方法对各候选内参基因的表达稳定性进行分析。
7.权利要求1所述的山药不同组织荧光定量的内参基因在山药基因表达分析中的应用。
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