[发明专利]重组鼠李糖脂生产菌及其应用

说明书

本发明涉及应用微生物和基因工程技术领域，特别是涉及一株重组鼠李糖脂生产菌及其利用该菌株发酵产鼠李糖脂发酵的应用。本发明方法将来自于粪透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)的血红蛋白基因vgb连接到表达载体上构建重组载体PBBR1MCS‑5‑vgb，并将该重组表达载体转化铜绿假单胞菌，血红蛋白的表达促进了菌体的生长和鼠李糖脂的合成，降低了发酵所需的通气量和发酵温度，为有效降低鼠李糖脂发酵生产的成本提供了新技术方案。

技术领域

本发明涉及应用微生物和基因工程技术领域，特别是涉及一株重组鼠李糖脂生产菌及其利用该菌株发酵产鼠李糖脂发酵的应用。

背景技术

鼠李糖脂(rhamnolipids)是一种由微生物合成的次级代谢产物，属于糖脂类生物表面活性剂。鼠李糖脂作为生物表面活性剂具有优异的的表/界面活性以及发泡、乳化、破乳、去污、增溶、鳌合金属、极端环境下稳定性好，相比目前大量使用的化学合成表面活性剂，鼠李糖脂毒性低，环境友好，易降解，在石油开采、污染治理、农业、工业、食品等领域都具有广泛的应用前景。

目前，鼠李糖脂的应用问题在于较低的产量和较高的发酵成本导致其市场价格远远高于廉价的化学合成表面活性剂，从而限制了鼠李糖脂的规模化应用。因此，提高鼠李糖脂产量，降低发酵过程的能耗，都有助于降低发酵成本，利于鼠李糖脂的市场化应用。

专性好氧的透明颤菌(Vitreoscilla)能够在贫氧的条件下生存，是因为其细胞内表达一种血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)，该蛋白能够提高细胞对氧气的利用能力。VHb在多种异源宿主细胞表达后，对细胞生长和产物合成有积极的促进作用，因此，可以通过引入血红蛋白来提高发酵产物产量和降低发酵过程中的所需通气量，另外，较低的温度条件会扩大血红蛋白对菌株生长和产物合成的这种积极的作用。因此，血红蛋白可以在一定程度上有效在降低鼠李糖脂发酵成本。

发明内容

本发明的目的是提供了一株重组鼠李糖脂生产菌及其构建方法和利用该菌株发酵产鼠李糖脂发酵的应用。粪透明颤菌(Vitreoscilla stercoraria)的血红蛋白VHb。

为实现上述目的，本发明中所采用的技术方案为：

一种重组鼠李糖脂生产菌，重组菌株含透明颤菌属粪透明颤菌的血红蛋白基因的重组质粒。

所述宿主菌株为铜绿假单胞菌。

所述透明颤菌属粪透明颤菌的血红蛋白基因的重组质粒为将粪透明颤菌的完整血红蛋白基因vgb，连接到表达载体pBBR1MCS-5上，构建表达血红蛋白的质粒pBBR1MCS-5-vgb。

通过氯化钙热激法将所述重组质粒转化至铜绿假单胞菌，抗性筛选得到表达血红蛋白的产鼠李糖脂重组菌。

一种重组鼠李糖脂生产菌的应用，所述重组鼠李糖脂生产菌在促进鼠李糖脂的合成中的应用。

所述重组菌株于种子液中在30～37℃，150～180rpm下培养16～24小时；而后将种子液按3～5％的接种量接种至发酵培养基中在26～38℃，100～200rpm，培养5～7天。

所述种子液培养基按重量百分比计，酵母粉0.5-1.2％，蛋白胨1-2.4％，氯化钠1-2％，余量为水；

所述发酵培养基按重量百分比计，丙三醇3-5％，大豆油1-1.5％，硝酸盐0.3-0.4％，磷酸盐1.5-1.8％，氯化钠0.1-0.15％，氯化钾0.1-0.2％，镁盐0.07-0.09％，钙盐0.01-0.03％，硫酸锰0.01-0.02％，硫酸锌0.2-0.28％，余量为水，PH6.7～7.0。

所述硝酸盐为硝酸钠和/或硝酸钾；镁盐为氯化镁和/或硫酸镁；钙盐为碳酸钙和/或硫酸钙；磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种。