[发明专利]一种人工纤维素水解酶及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种人工纤维素水解酶及其制备方法和应用，属于生物化学技术领域。该人工纤维素水解酶中以聚酰胺模拟天然纤维素水解酶的多肽骨架，通过在聚酰胺主链上挂接多个羧基官能团，模拟天然纤维素水解酶中的活性部位，从而构建出在分子结构和功能上双重模拟天然纤维素水解酶的人工酶新体系，实现了在温和条件下对纤维素催化水解的高活性和高选择性，并具有天然酶没有的成本低、易回收、稳定性高等优点，为仿生酶的设计合成，纤维素的有效降解，解决当前资源、能源和环境问题提供理论依据和参考。该酶制备方法简单，易操作，且成本低，适合扩大化生产。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种人工纤维素水解酶及其制备方法和应用。

背景技术

天然酶具有高活性、高选择性和专一性的特点，是分子量从一百多万到数百万的球蛋白，由一百到三百多个氨基酸残基组成，至今大约有2000多种酶被鉴定出来，并得到其中几百种的晶体，有些如糖苷水解酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等，已经测定了一级、二级和三级结构，三级结构被用来解释酶-底物互补契合的锁-钥模型。Breslow指出，天然酶把结合部位与处于适当位置的一个或多个催化基团组合在一起，以便与被结合的底物相互作用，并降低反应的结合过渡态能垒。酶分子的结合部位与底物结合并使之定向，这里的微环境比在本体溶剂中对反应有利得多，因而达到惊人的催化速度，比一般的催化剂约高10⁶-10⁸倍。

纤维素广泛地存在于植物、藻类、农业废弃物等生物质中,它是葡萄糖单元经β-1,4-糖苷键结合的多糖难溶性聚合物，是由光合作用产生的、地球上最丰富且可通过生物或化学方法降解的可再生资源。全世界每年由于光合作用而产生的有机生物质达1.18×10¹¹吨，其中40-50％都是纤维素。纤维素的有效降解和转化已成为木质纤维素生物质有效利用的关键技术。纤维素降解和转化方法的研究已成为当今科技界的一大研究热点，它对解决当前的资源、能源和环境问题都具有重要意义。

纤维素水解主要有酸水解法、超临界水解法、固体酸催化法、纤维素酶催化水解法、模拟酶催化水解法等方法。纤维素水解酶中的氨基酸的羧基端进行催化作用(催化机理见图1)，具体为：纤维素水解酶的其余有效基团对纤维素进行定位，两个羧基协同作用，其中一个羧基上氢原子与β-1，4糖苷键上的氧原子形成氢键，并起到电子诱导、活化作用，同时另一个羧基的氧负离子进攻显正电性的碳原子，此时β-1，4糖苷键发生断裂，生成葡萄糖羧酸酯，随后葡萄糖羧酸酯发生水解断裂，生成糖类产物。纤维素的生物酶催化法具有条件温和、产率高、绿色环保等优势，但天然酶价格昂贵、反应时间长、不易回收、易在反应过程中变性，这些缺点制约了其在工业生产中的应用。因此，用化学方法设计合成具有酶的功能，同时具有天然酶没有的稳定性甚至专一选择性的模拟酶(或人工酶)来代替天然酶的研究具有重要的理论意义和实践应用价值。

天然酶的模拟分为三个层次：第一层次是模拟物只含有与天然酶相同的金属离子——第一级近似，这一层次的模拟物成本低，可大量合成，但作用机理不同于天然酶，选择性及反应效率也远不如天然酶；第二层次是模拟活性中心催化基团结构，比如用三亚乙基四胺合成铁(Ⅲ)配合物来模拟过氧化氢酶，用该化合物来进行如催化机理的研究较方便，但模拟物由于不具备天然酶的微环境，催化选择性较低；第三层次是天然酶的整体模拟，催化活性中心必须处在一个特定的微环境和整体结构之中(结合部位)，所以高级模拟是包括微环境在内的整个活性部分。故要获得媲美于天然酶的人工模拟酶，就必须既模拟天然酶的活性催化中心，又模拟其由多肽链构建的微环境。

综上所述，纤维素模拟酶具有绿色、高效、清洁、反应条件温和、稳定性好、设备成本低等优点，这是其他传统催化技术方法所无法比拟的，具有远大的潜力和发展前景，已成为当前研究纤维素催化降解的发展方向。然而至今为止，这方面的研究还刚刚起步，所涉及的模拟酶体系结构较为单一、催化效率不高。目前，对天然酶进行活性部位和催化微环境双重模拟的研究尚未见报道。

发明内容