[发明专利]一种牙周炎致病菌的分离方法

权利要求书

1.一种牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

细菌的采样：取出无菌牙线棒，将牙线嵌入人体的牙缝间，在牙龈处往返拉动至少两次，取出牙线，将牙线的纤维线浸入至已经过厌氧预平衡处理的TSB液体培养基中，无菌枪头吹打数次，制成原始样本悬液，放入厌氧培养箱中待用；

分离培养基的配制：按重量组分计，将10～20份混合蛋白胨、5～10份酵母浸出粉、1～5份氯化钠、10～15份琼脂、0.5～1.0份葡萄糖、0.2～0.8份碳酸氢钠、0.1～0.5份L-半胱氨酸盐、0.1～0.5份可溶性焦磷酸钠混合，加水定容至1L，高压锅灭菌后，在高压锅内将温度降至65～75℃时，取出放于60℃水浴锅中缓慢降温；然后加入0.0001～0.0005份血红素、0.00001～0.00005份维生素K和5～10份无菌脱纤维绵羊血，混匀，获得液体的分离培养基；将液体的分离培养基倒平板，冷却，获得固体的分离培养基；

细菌的培养：从厌氧培养箱中取出所述原始样本悬液，37℃厌氧条件下经过所述分离培养基的培养产生特征性单克隆。

2.根据权利要求1所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，在进行所述细菌的培养之前还需要进行分离培养基的厌氧预平衡处理，具体步骤包括：

将所述分离培养基放入37℃厌氧培养箱中保持24h。

3.根据权利要求2所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的培养包括：

细菌的初代培养：从厌氧培养箱中取出所述原始样本悬液，无菌接种环沾取适量样本，采用分区连续划线法，划至已经过厌氧预平衡处理的所述分离培养基上，37℃厌氧条件下培养7～10天；

PCR检测：用无菌枪头挑取黑色圆形凸起的单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液后，取2～4μL进行直接PCR检测；

细菌的传代培养：经PCR检测为阳性后，将剩余菌液用无菌接种环分区连续划线至已经过厌氧预平衡处理的所述分离培养基上，继续37℃厌氧条件下培养7～10天；

其中，依次重复所述PCR检测步骤和所述细菌的传代培养步骤至少一次，至所述分离培养基上形成单一的墨黑色圆形特征克隆。

4.根据权利要求3所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述牙周炎致病菌的分离方法还包括细菌的鉴定，具体步骤如下：

挑取墨黑色圆形特征单克隆至10～20μL TSB液体培养基中，混匀菌液后，进行直接PCR检测或者革兰氏染色鉴定或者16S rDNA基因测序鉴定中的任意一种或者任意两种或者全部。

5.根据权利要求4所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的培养中的PCR检测和所述细菌的鉴定中的PCR检测中所用的引物包括第一上游引物和第一下游引物；

所述第一上游引物的序列为：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’；

所述第一下游引物的序列为：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。

6.根据权利要求5所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的培养中的PCR检测和所述细菌的鉴定中的PCR检测中的PCR扩增反应体系为：

PCR扩增反应程序为：

95℃，10min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，20s，36个循环；72℃，10min。

7.根据权利要求2所述的牙周炎致病菌的分离方法，其特征在于，所述细菌的培养包括：

菌液的稀释：取两份5μL的原始样本悬液，分别以原始样本悬液与TSB液体培养基体积比为1:100和1：10000的比例将TSB液体培养基加入原始样本悬液中对原始样本悬液进行稀释，获得第一稀释菌液和第二稀释菌液；

细菌的初代培养：分别取100μL第一稀释菌液和100μL第二稀释菌液，采用涂布法接种于已经过厌氧预平衡处理的所述分离培养基上，37℃厌氧培养7～10天，至培养出黑色圆形凸起的单克隆。