[发明专利]一种酰基转移酶及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种酰基转移酶及其编码基因和应用。所述的酰基转移酶Tri18，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次从广藿香内生真菌露湿漆斑菌Myrothecium roridum A553中发掘了在D型单端孢霉烯大环结构形成过程中发挥重要作用的新型酰基转移酶Tri18。本发明所得的新型酰基转移酶Tri18能和乙酰CoA发生相互作用，发挥酰基转移的作用。本发明为解析单端孢霉烯的生物合成途径并促进酰基转移酶在生物催化中的应用奠定分子生物学基础，从而为解析露湿漆斑菌中单端孢霉烯的生物合成机制奠定了分子生物学基础，也为促进酰基转移酶在生物转化中的应用提供了物质基础。

技术领域：

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新型植物内生真菌露湿漆斑菌来源的新型酰基转移酶及其编码基因和应用。

背景技术：

露湿漆斑菌是一种对大豆等经济作物具有显著致病性的病原菌，对我国大豆的产量造成了不可估量的损失。据研究报道，单端孢霉烯毒素是露湿漆斑菌的重要致病因子。本发明人前期从药用植物广藿香内生真菌中分离得到了露湿漆斑菌A553，从中分离获得了大量单端孢霉烯类化合物，对肿瘤细胞具有显著的细胞毒活性。单端孢霉烯毒素与靶向药物的结合在抗肿瘤药物开发方面有巨大的应用前景。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种植物内生真菌露湿漆斑菌来源的新型酰基转移酶Tri18。

本发明的新型乙酰转移酶Tri18，是通过以下方法制备的：

以广藿香内生真菌露湿漆斑菌Myrothecium roridumA553基因组为模板，根据基因簇Tricluster中的Tri8基因序列(如SEQ ID NO.1所示)设计引物，通过分段式扩增融合PCR获得酰基转移酶Tri18的编码基因-基因Tri18。回收目的片段，采用ClonExpress UltraOne Step Cloning Kit(诺唯赞生物科技有限公司，南京)同源重组试剂盒将目的基因插入用限制性内切酶NdeI、HindⅢ双酶切的表达载体pET30a，用含50μg/mL Kana的LB平板筛选，挑取克隆扩大培养，采用菌液PCR扩增Tri18基因筛选阳性克隆并测序验证。Ni亲和层析柱对酰基转移酶Tri18进行纯化，用含不同浓度咪唑的洗脱液进行洗脱，从而获得纯的酰基转移酶Tri18。以乙酰CoA，丁醇为底物，加入酰基转移酶Tri18，并加入DTNB进行显色，通过检测412nm处的吸光值测定酰基转移酶Tri18的活力，其Vmax为307.7±10.91U/mg，Km为376.5±30.07μM，Kcat为1538.5S^-1，Kcat/Km为245.18μM/min。酰基转移酶Tri18在250μM乙酰辅酶A，pH＝8.0，室温反应条件下的酶活大概是115U/mg。

本发明的酰基转移酶Tri18，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述酰基转移酶Tri18的编码基因。

所述的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供上述酰基转移酶Tri18在催化酰基转移形成酯或酰胺中的应用。

酰基转移酶在活性次级代谢产物骨架的生物合成及其后修饰过程中发挥重要功能，本发明首次从广藿香内生真菌露湿漆斑菌Myrothecium roridum A553中发掘了在D型单端孢霉烯大环结构形成过程中发挥重要作用的新型酰基转移酶Tri18。本发明所得的新型酰基转移酶Tri18能和乙酰CoA发生相互作用，发挥酰基转移的作用。本发明为解析单端孢霉烯的生物合成途径并促进酰基转移酶在生物催化中的应用奠定分子生物学基础，从而为解析露湿漆斑菌中单端孢霉烯的生物合成机制奠定了分子生物学基础，也为促进酰基转移酶在生物转化中的应用提供了物质基础。

附图说明