[发明专利]一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，在出发菌株基础上存在下述之一的位点突变情况：

1)purR^A148D：嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；

2)ribC^D144R：双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；

3)purR^A148D和ribC^D144R：嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；

4)purR^A148D、ribC^D144R和pyrE^K104E：嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸；

其中，所述PurR蛋白序列如SEQ NO.7所示；所述RibC蛋白序列如SEQ NO.9所示；所述PyrE蛋白序列如SEQ NO.11所示；且所述出发菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168。

2.如权利要求1所述的产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO.21202。

3.一种枯草芽孢杆菌嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQ NO.2所示；编码的蛋白如SEQ NO.8所示。

4.一种枯草芽孢杆菌双功能黄素激酶FAD合成酶RibC的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQ NO.4所示；编码的蛋白如SEQ NO.10所示。

5.一种枯草芽孢杆菌乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQ NO.6所示；编码的蛋白如SEQ NO.12所示。

6.一种产核黄素工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)在出发菌株的染色体上整合了purR、ribC或pyrE的基因，其存在下述之一的基因突变情况：

1）purR的基因存在突变；具体为purR的148位丙氨酸突变为天冬氨酸；

2）ribC的基因存在突变；具体为ribC的144位天冬氨酸突变为精氨酸；

3）purR和ribC的基因存在突变；具体为purR的148位丙氨酸突变为天冬氨酸，ribC的144位天冬氨酸突变为精氨酸；

4）purR、ribC和pyrE的基因存在突变；具体为purR的148位丙氨酸突变为天冬氨酸，ribC的144位天冬氨酸突变为精氨酸，pyrE的104位赖氨酸突变为谷氨酸；

其中，所述purR基因编码的蛋白如SEQ NO.7所示；所述ribC基因编码的蛋白如SEQNO.9所示；所述pyrE基因编码的蛋白如SEQ NO.11所示；所述出发菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168；

(2)获得较出发菌株相比核黄素产量提高的菌株。

7.一种制备核黄素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将甘油管保藏的权利要求1所述产核黄素的枯草芽孢杆菌在LB平板进行无菌划线，36℃过夜培养；

(2)挑一环培养物接种至30 mL种子培养基中，110 rpm，36℃培养7~8 h；

(3)按10%接种量转接至30 ml 发酵培养基中，摇床转速120 rpm，36℃培养40h。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，种子培养基配方(g/L)为：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；发酵培养基配方(g/L)为：葡萄糖50，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。