[发明专利]基于CRISPR技术对大肠杆菌K4进行基因插入的方法

说明书

本发明公开了基于CRISPR技术对大肠杆菌K4进行基因插入的方法。本发明涉及生物技术基因编辑领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统的外源基因靶向大肠杆菌中染色体的方法。本发明方法包括：利用导入的λRed同源重组系统和CRISPR系统实现在大肠杆菌K4的LacZ基因中插入靶基因。本发明建立了一种高效、简单的将大肠杆菌传统基因编辑技术与CRISPR系统相结合的靶基因定位插入方法。与现有大肠杆菌K4基因编辑方法相比，本发明提供的方法能够在大肠杆菌中实现高效准确的目的基因插入工作。本发明提供的细菌中基因插入方法操作简便快捷，实验成本较低，尤其适用于高通量基因编辑工作。

技术领域

本发明涉及生物技术基因敲除领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统的外源基因靶向大肠杆菌中染色体的方法。

背景技术

大肠杆菌K4(ATCC 23502)的荚膜多糖结构为硫酸软骨素类似物果糖软骨素，提高果糖软骨素产量一直以来都是热点研究问题。目前对大肠杆菌K4进行染色体水平上靶基因的改造有如下两种方法：一是利用其自身RecA同源重组系统编码的重组蛋白介导DNA发生同源重组；二是通过引入外源重组酶λ-Red或RecET提高同源重组效率。上述两种均是通过DNA分子发生双交换实现对靶基因的编辑。这些传统的大肠杆菌K4同源重组技术通常需要外源性辅助质粒以及筛选标记基因，对靶基因进行敲除及插入等实验操作，但当对靶基因进行点突变等更加精准的操作时，这些重组技术存在重组效率低、流程繁琐等缺点，想要大规模应用仍然面临巨大的挑战。

CRISPR/Cas9系统改造的碱基编辑器，是目前对核酸碱基进行点突变应用较为广泛的方法，作为一种新型基因编辑工具，该技术仍存在脱靶率高、编辑窗口局限等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种将大肠杆菌传统的基因编辑技术与CRISPR/Cas9技术相结合，快速、高效的实现大肠杆菌K4靶基因定点插入的方法。

第一方面，本发明要求保护一种对大肠杆菌K4基因组中靶基因进行定点插入的方法。

本发明所要求保护的对大肠杆菌K4基因组中靶基因进行定点插入的方法，可包括如下步骤：

(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌K4，获得大肠杆菌K4 pCas9；

(2)根据靶标基因LacZ设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTarget-F质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物经过Dpn I消化、磷酸化、T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子，送去测序验证，提取含靶标基因20个核苷酸序列的pTarget-F质粒；

(3)以大肠杆菌K4基因组为模板，根据PgapA基因和待插入基因位点上下游核苷酸序列设计引物P3、P4、P5和P6，PCR扩增待插入的DNA片段；

(4)以大肠杆菌K4基因组为模板，设计引物P1、P2、P7和P8，PCR扩增lacZ上下游同源序列的DNA片段；构建携带待插入基因和lacZ基因上下游同源序列的Donor DNA片段；

(5)将步骤(2)获得的辅助质粒pTarget-F和步骤(4)获得的DNA片段通过电击转化的方法转入大肠杆菌K4 pCas9感受态细胞，获得插入基因的重组大肠杆菌。

进一步，步骤(5)辅助质粒pTarget-F和DONOR DNA片段质量比优选1∶4；

进一步，步骤(5)转入方法为：将辅助质粒pTarget-F和DONOR DNA片段与大肠杆菌K4 pCas9感受态细胞混合，轻弹混匀，加入预冷的电击杯中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪(Bio-Rad)的杯槽中，转化条件：电击后迅速加入液体培养基，30℃静置培养2h进行复苏，离心3min，弃掉多余上清液，将菌体重悬后涂布于LB双抗固体培养基，获得基因重组的大肠杆菌K4；