[发明专利]构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的方法及其应用

权利要求书

1.一种构建表达焦亡蛋白的溶瘤腺相关病毒oAAVs的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)扩增获得焦亡蛋白基因

扩增获得焦亡蛋白的基因；其中，焦亡蛋白的基因GSDMD-NT和GSDME-NT；其核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示；

2)包装oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR

a.将pAAV-SS质粒用Asc I及Nhe I进行双酶切，回收载体片段AAV-SS；所述pAAV-SS质粒为带有Cre重组酶特异识别的特异位点序列Lop的pAAV-Lop质粒或带有Flp重组酶特异识别的特异位点序列FRT的pAAV-FRT质粒；其中，pAAV-Lop质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，pAAV-FRT质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

b.设计扩增引物，以焦亡蛋白的基因GSDM-NT为模板，扩增获得两端含有Asc I及Nhe I酶切位点序列的GSDM-NT基因片段，用Asc I及Nhe I进行双酶切回收后与载体片段AAV-SS连接后转化Stbl3感受态，送测序鉴定，获得核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT；其中，GSDM-NT扩增引物为：

GSDMD-NT的引物：

GSDMD-NT-F：5’-ttgggcgcgccatggggtcggcctttgagcg-3’；

GSDMD-NT-R：5’-ctagctagcctaatctgtcaggaagttgtg-3’；

GSDME-NT的引物：

GSDME-NT-F：5’-ttgggcgcgccatgtttgccaaagcaaccag-3’；

GSDME-NT-R：5’-ctagctagctcaatctggcatgtctatg-3’；

c.无内毒素提取pAAV-SS-GSDM-NT、辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper，将核心质粒pAAV-SS-GSDM-NT与辅助质粒pAAV-DJ和辅助质粒pAAV-Helper共转染HEK 293T细胞；重悬HEK 293T细胞后，反复冻融和离心，收集含重组腺相关病毒上清；然后经孵育、纯化和浓缩；得到oAAV-SS-GSDM-NT；

d.利用上述方法，使用质粒pAAV-SSR、质粒pAAV-DJ和质粒pAAV-Helper共转染包装获得oAAV-SSR；其中，pAAV-SSR质粒为带有Cre重组酶序列的pAAV-Cre质粒或带有Flp重组酶序列的pAAV-Flp质粒；其中，Cre重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，Flp重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

3)获得溶瘤腺相关病毒oAAVs

将oAAV-SS-GSDM-NT和oAAV-SSR混合获得oAAVs，分装后于-80℃保存。

2.一种权利要求1所述方法获得的溶瘤腺相关病毒oAAVs在制备治疗肿瘤的药品中的应用，其中，所述肿瘤为脑胶质瘤，乳腺癌、肝癌及宫颈癌。

3.一种治疗肿瘤的组合药剂，其特征在于：所述组合药剂包括有效量的权利要求1所述方法获得的溶瘤腺相关病毒oAAVs、免疫调节剂和辅料，且所述肿瘤为脑胶质瘤，乳腺癌、肝癌及宫颈癌。

4.根据权利要求3所述的治疗肿瘤的组合药剂，其特征在于：免疫调节剂为程序性细胞死亡受体1分子阻断剂或程序性细胞死亡配体1分子阻断剂或PD-L1抗体或PD-1抗体。

5.根据权利要求4所述的治疗肿瘤的组合药剂，其特征在于：所述免疫调节剂为PD-L1分子阻断剂。