[发明专利]RPA联合CRISPR技术检测炭疽杆菌的方法及成套试剂

权利要求书

1.用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的成套引物组，由如下组成：

(A1)引物组1：由RPA引物对1和crRNA1组成；

所述RPA引物对1为由SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成的引物对；所述crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；

(A2)引物组2：由RPA引物对2和crRNA2组成；

所述RPA引物对2为由SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的两条单链DNA组成的引物对；所述crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；

(A3)引物组3：由RPA引物对3和crRNA3组成；

所述RPA引物对3为由SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的两条单链DNA组成的引物对；所述crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示。

2.用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的试剂盒，含有权利要求1所述的成套引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有如下中的全部或部分：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合酶、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和醋酸镁。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有cas12a蛋白和/或信号报告探针和/或成套阳性参考质粒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述信号报告探针的序列如SEQ IDNo.34所示，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述成套阳性参考质粒由阳性参考质粒1、阳性参考质粒2和阳性参考质粒3组成；所述阳性参考质粒1为含有SEQ ID No.1的第8-517位所示DNA片段的质粒；所述阳性参考质粒2为含有SEQ ID No.2的第4-753位所示DNA片段的质粒；所述阳性参考质粒3为含有SEQ ID No.3的第5-872位所示DNA片段的质粒。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。

9.权利要求1所述的成套引物组或权利要求2-8中任一所述的试剂盒在如下任一中的应用：

(A1)制备用于检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的产品；

(A2)制备用于诊断炭疽芽孢杆菌感染的产品；

(A3)制备用于诊断炭疽病的产品。

10.一种检测炭疽杆菌和/或筛查炭疽芽孢杆菌毒力株的非疾病诊断性方法，包括如下步骤：

(b1)从待测样本中提取DNA；

(b2)以(b1)提取的DNA为模板，采用权利要求1中所述的RPA引物对1、所述RPA引物对2和所述RPA引物对3分别进行RPA扩增，依次得到扩增产物1、扩增产物2和扩增产物3；

(b3)取(b2)所得扩增产物1，加入权利要求4或6或8中所述的信号报告探针、权利要求4或5中所述的cas12a蛋白和权利要求1中所述的crRNA1，形成反应体系1；取(b2)所得扩增产物2，加入权利要求4或6或8中所述的信号报告探针、权利要求4或5中所述的cas12a蛋白和权利要求1中所述的crRNA2，形成反应体系2；取(b2)所得扩增产物3，加入权利要求4或6或8中所述的信号报告探针、权利要求4或5中所述的cas12a蛋白和权利要求1中所述的crRNA3，形成反应体系3；将所述反应体系1、所述反应体系2和所述反应体系3分别进行CRISPR反应检测，读取检测信号，根据检测信号按照如下确定检测结果：

若所述反应体系1的检测信号为阳性，则所述待测样本中含有或候选含有炭疽芽孢杆菌；若所述反应体系1的检测信号为阴性，则所述待测样本中不含有或候选不含有炭疽芽孢杆菌；

在所述反应体系1的检测信号为阳性的情况下，若所述反应体系2和所述反应体系3的检测信号也均为阳性，则所述待测样本中含有或候选含有的炭疽芽孢杆菌为或候选为毒力株；若所述反应体系2和所述反应体系3的检测信号均为阴性，则所述待测样本中含有或候选含有的炭疽芽孢杆菌不为或候选不为毒力株。