[发明专利]一种腺苷的发酵菌株及其制备工艺优化

说明书

一种高效产腺苷的菌株Bacillus subtilis‑117的构建。以实验室Bacillus subtili ATCC 21616为原始菌株，通过Crispr Cas9技术，基因敲除肌酐酸脱氢酶，再经过传统诱变下调AMP脱氨酶基因表达的菌株Bacillus subtilis‑117，该菌株腺苷产量达到13.96g/L。Crispr Cas9为近些年来研究最热门的基因编辑技术，本发明第一次将该技术应用到产腺苷菌株优化中，获得了稳定高效产腺苷菌株。

技术领域

本发明属于生物制药工艺领域，具体涉及一种腺苷的发酵制备工艺。

背景技术

腺苷又称腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤，其化学结构式为

腺苷是人体细胞中具有重要生理功能的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸而参与心肌的能量代谢，同时还参与扩张动脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其他系统和组织均有生理作用。此外，腺苷还是用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。国内市场需求量很大，具有十分广阔的发展前景。生物发酵法制备腺苷相对于化学合成法来说，具有绿色环保，工艺路线简单，节约成本，效率高等优势。

发明内容

一株高产菌株Bacillus subtilis-117腺苷的构建，设计sgRNA序列（SEQ IDNO.1）,将所设计的序列与质粒pJOE8999进行全合成，并温转入Bacillus subtili ATCC21616细胞。配置TSA培养基，配方如下：酪蛋白胰酶消化物15g/L，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L。121℃灭菌20min，降温后过滤加入100mg/L卡那霉素，制备平板，并进行平板划线，挑选出阳性菌落送检测序后确认无误后获得Bacillus subtilis-11。将所获得的菌株通过紫外诱变，挑选出高产菌株Bacillus subtilis-117。

Bacillus subtilis-117发酵制备工艺，它包括如下步骤：（1）发酵提取：将大孔树脂加入培养基中一起灭菌，进行发酵培养，细胞合成腺苷后，在发酵液中被大孔树脂吸附在其中。发酵结束后，用100目的筛网过滤发酵液，收集大孔树脂。（2）除杂：先用纯水洗去树脂表面残留的发酵液，然后将树脂装入层析柱，先用10%~20%乙醇洗脱除杂。（3）洗脱：用40%~70%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩。（4）脱色：加入浓缩液质量1%~2%的活性炭进行脱色，脱色温度70~80℃，脱色时间15~30min。（5）结晶分离：脱色液继续浓缩至腺苷含量为100g/L~150g/L，温度降至0~5℃，保冷4~6h，使得腺苷结晶析出，然后过滤分离，得到含量和纯度均在95%以上的腺苷成品。

具体实施方式

实施例1

一、发酵

1.菌种培养

（1）种子培养基：葡萄糖15g/L，酵母浸粉6g/L，胰蛋白胨12g/L，氯化钠12g/L；

（2）用一次性无菌接种针沾取甘油菌接入含有100mL已灭菌的种子培养基中，33℃，220rpm摇床培养16h，制备种子液；

2.发酵培养

（1）发酵培养基：蔗糖50g/L，硫酸铵6g/L，酵母膏8g/L，谷氨酸钠5g/L，七水硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，一水硫酸锰100mg/L，七水硫酸亚铁50mg/L，豆油10mL/L，SP850大孔吸附树脂20g/L，pH为6.8；

（2）将种子液以10%接种量转接入含300mL的发酵培养基中，33℃，220rpm摇床培养48h，得发酵液；