[发明专利]一种新型细胞外基质生物支架材料及其制备方法

权利要求书

1.一种新型细胞外基质生物支架材料，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

(1)分离培养兔子的骨髓干细胞，在体外成膜诱导培养，获得骨髓干细胞膜片；

(2)将获得的骨髓干细胞膜片在磷酸缓冲盐溶液中漂洗；

(3)用十二烷基硫酸钠脱细胞液进行多次脱细胞处理，然后用磷酸缓冲盐溶液漂洗；

(4)随后加入Triton-X100去除残留的细胞碎片，再次用磷酸缓冲盐溶液漂洗；

(5)再去除残留的DNA和RNA，最后再用磷酸缓冲盐溶液漂洗，获得生物支架材料。

2.根据权利要求1所述的一种新型细胞外基质生物支架材料，其特征在于，步骤(1)中分离培养兔子的骨髓干细胞包括以下步骤：

a.用速眠新Ⅱ号与氯胺酮混合后对兔子进行肌肉注射将兔子麻醉，俯卧位放置，进行备皮和消毒，双侧髂嵴表面用盐酸利多卡因局部浸润麻醉；

b.逐层切开双侧髂嵴皮肤皮下组织，切取双侧髂骨、四肢股骨和胫骨，去除表面骨膜及软骨，在超净工作台内用含有肝素、胎牛血清、青霉素和L-谷胺酰胺的DMEM-F12培养基冲洗髓腔，获得骨髓液；

c.将步骤b中获得的骨髓液进行过滤，将过滤后的骨髓液接种到培养皿中，置于37℃、5％CO₂的孵箱内培养；

d.接种后第47.5-48.5小时进行一次半换液，再过71.5-72.5小时后进行一次全换液，此后每隔两天进行一次全换液，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，选用第一代骨髓干细胞诱导成膜片。

3.根据权利要求2所述的一种新型细胞外基质生物支架材料，其特征在于，所述兔子为健康4周龄雄性新西兰白兔。

4.根据权利要求1所述的一种新型细胞外基质生物支架材料，其特征在于：步骤(1)中体外成膜诱导的培养基采用含58-62μg/ml抗坏血酸和20-22％胎牛血清的高糖培养基，诱导培养时间为2-4周。

5.根据权利要求1所述的一种新型细胞外基质生物支架材料，其特征在于，步骤(3)为：加入0.5％-1.5％的十二烷基硫酸钠脱细胞液进行脱细胞，并在30-60分钟后进行第一次更换新的十二烷基硫酸钠脱细胞液，再过1-2小时进行第二次更换新的十二烷基硫酸钠脱细胞液，再过4-6小时进行第三次更换新的十二烷基硫酸钠脱细胞液，第三次换液后脱细胞处理24-36小时，然后用磷酸缓冲盐溶液漂洗。

6.根据权利要求1所述的一种新型细胞外基质生物支架材料，其特征在于：步骤(4)中加入Triton-X100浸泡作用29-31分钟去除残留的细胞碎片，Triton-X100的浓度为0.5％-1％。

7.根据权利要求1所述的一种新型细胞外基质生物支架材料，其特征在于：步骤(2)中漂洗次数为三次，步骤(3)中漂洗次数为三次，步骤(4)中漂洗次数为三次，漂洗时间均为4.5-5.5分钟，漂洗采用恒温振荡器进行，转速为145-155rpm。

8.根据权利要求1所述的一种新型细胞外基质生物支架材料，其特征在于，步骤(5)为：加入含有DNA酶和RNA酶的DMEM浸泡作用23.5-24.5小时去除残留的DNA和RNA，所述DMEM中DNA酶和RNA酶的含量均为1％，最后再用磷酸缓冲盐溶液漂洗，获得生物支架材料。

9.根据权利要求8所述的一种新型细胞外基质生物支架材料，其特征在于，步骤(5)中再用磷酸缓冲盐溶液漂洗为：再用磷酸缓冲盐溶液漂洗三次，每次2.5-3.5分钟，然后再用磷酸缓冲盐溶液漂洗24-36小时。

10.一种权利要求1-9任一所述的一种新型细胞外基质生物支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离培养兔子的骨髓干细胞，在体外成膜诱导培养，获得骨髓干细胞膜片；

(2)将获得的骨髓干细胞膜片在磷酸缓冲盐溶液中漂洗；

(3)用十二烷基硫酸钠脱细胞液进行多次脱细胞处理，然后用磷酸缓冲盐溶液漂洗；

(4)随后加入Triton-X100去除残留的细胞碎片，再次用磷酸缓冲盐溶液漂洗；

(5)再去除残留的DNA和RNA，最后再用磷酸缓冲盐溶液漂洗，获得生物支架材料。