[发明专利]一种扩增鼠单抗重轻链基因序列的方法及其引物和筛选该引物的方法

说明书

本申请公开了一种扩增鼠单抗重轻链基因序列的方法及其引物，以及筛选所述引物的方法，其中，各复合引物所用的正向引物均为组合物，所述复合引物通过预先筛除可扩增非功能性基因序列的引物对而得，并且，每组正向引物均已剔除扩增Sp2/0细胞非功能轻链基因的引物，采用本申请提供的复合引物进行PCR扩增，所得引物无需做TA克隆，而是能够满足测序的纯度要求，进一步地，采用本申请提供的复合引物能够减少扩增管的数量，简化扩增操作，使PCR扩增的操作更为简单方便。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及扩增小鼠杂交瘤细胞中单克隆抗体重、轻链基因序列的方法及其引物，以及筛选所述引物的方法。

背景技术

单克隆抗体在生物医学领域应用广泛，同时在体外诊断(In Vitro Diagnosis，IVD)等领域发挥重要作用。从杂交瘤细胞中通过基因测序技术获得抗体重、轻链序列，是进行单抗资源永久保存、构建重组抗体以及进行抗体体外亲和力成熟等操作的首要步骤。

用于杂交瘤细胞融合的Sp2/0细胞中含有内源性非功能基因，这些序列不能有效翻译成蛋白质，因此，从杂交瘤细胞中扩增抗体轻链基因序列时，所述内源性非功能基因序列会产生假阳性干扰。

目前，多种策略被用于从杂交瘤细胞中扩增轻链抗体基因，其中最常用是采用限制性内切酶方法去除内源性非功能基因，但这种方法操作复杂并且效率不高；另一种方法是将扩增产物构建TA克隆，再将TA克隆后纯化所得多个克隆分别进行测序鉴定，排除内源性非功能基因，但是，这种方法同样费时费力。

发明内容

本申请提供一种扩增鼠单克隆抗体，特别是鼠单克隆抗体IgG重轻链基因的方法及所用的复合引物，所述方法使用特定复合引物，能够避免内源性非功能基因产生假阳性干扰，采用本申请提供的方法扩增所得产物较为纯净，目标扩增产物的含量较高，可直接用于测序研究。

本申请的目的在于提供鼠单抗kappa链扩增第一复合引物，所述鼠单抗kappa链扩增第一复合引物用于扩增鼠单克隆抗体kappa链，具体地，所述鼠单抗kappa链扩增第一复合引物包括第一正向扩增引物组KFA和kappa链反向扩增引物KR，其中，所述KFA来源于Antibody engineering。

在一种可实现的方式中，所述KFA包括以下引物：

KFA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

KFA2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

KFA3：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

KFA4：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

KFA5：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

KFA6：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；和

KFA7：其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述KFA中各引物等量组合。

进一步地，所述KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本申请的另一目的在于提供鼠单抗kappa链扩增第二复合引物，所述鼠单抗kappa链扩增第二复合引物也用于扩增鼠单克隆抗体kappa链，具体地，所述鼠单抗kappa链扩增第二复合引物包括kappa链第二正向扩增引物组KFB和kappa链反向扩增引物KR，其中，所述KFB来源于IMGT/PRIMER-DB。

在一种可实现的方式中，所述KFB包括以下以引物：

KFB1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

KFB2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；