[发明专利]基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架及制法

权利要求书

1.一种基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）首先将明胶基水溶液与蛋白水溶液混合后冷冻干燥得到复合蛋白多孔支架；

（2）然后向所述复合蛋白多孔支架上滴加培养菌液，直至复合蛋白多孔支架吸附培养菌液饱和后，加入菌株培养液进行静置培养；

（3）最后将步骤（2）中静置培养得到的复合物浸入浓度为0.1~5wt%的曲拉通水溶液中进行纯化后冷冻干燥制得基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架；

步骤（1）中，明胶基水溶液与蛋白水溶液混合后，调节混合溶液pH值为5~7；所述明胶基水溶液是将明胶颗粒与蛋白组分溶于去离子水中得到的，所述蛋白组分为牛血清白蛋白、血红蛋白和肌红蛋白的一种以上；所述蛋白水溶液为蚕丝蛋白、角质蛋白、还原角蛋白、血清蛋白、鱼胶蛋白、卵白蛋白、粘蛋白和血纤蛋白的一种以上的水溶液；

步骤（2）中，所述培养菌液是在浓缩菌液中加入菌株培养液并均匀分散得到；

所述培养菌液中的菌株细胞密度为10³~10¹³个/mL；

所述浓缩菌液由等电点为3.5~4的菌株依次经过活化、扩增和离心的工序获得；

所述离心的转速为2000~8000r/min，时间为3~5min；

所述菌株培养液是通过调节发酵培养液的pH值为5.0~6.0得到；

基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架的内毒素小于0.5EU/mL。

2. 根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架的制备方法，其特征在于，两次冷冻干燥的工艺参数均为：先在-196~-20℃温度条件下冷冻6~24h，再真空干燥12~24h。

3.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述明胶基水溶液是将明胶颗粒与蛋白组分溶于去离子水中，在35~45℃的温度条件下搅拌1~6h得到的；所述明胶基水溶液中明胶颗粒的含量为1~3wt%，所述蛋白组分的含量不高于1wt%；

所述蛋白水溶液的浓度为1~10wt%；

所述明胶基水溶液与所述蛋白水溶液的混合体积比例为1:0.2~5。

4.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤（2）中复合蛋白多孔支架吸附培养菌液饱和后在28~37℃的温度条件下静置10min~2h，之后再加入发酵培养液进行静置培养；

静置培养的温度为28~32℃，时间为5~9天；

所述发酵培养液是由如下含量的各组分配制而成：

葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇 1~6wt%；

蛋白胨 0.05~1wt%；

酵母膏 0.05~1wt%；

柠檬酸 0.01~0.5wt%；

磷酸氢二钠 0.04~0.4wt%；

磷酸二氢钾 0.02~0.2wt%；

磷酸氢二钾 0.02~0.2wt%；

水余量。

5.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述均匀分散是指采用漩涡混匀器在500~1000rpm下连续振动10~30s。

6.根据权利要求1所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述活化是将等电点为3.5~4的菌株置于50~500mL的发酵培养液中进行摇床培养；

摇床培养的转速为50~150r/min，温度为28~37℃，时间为6~24h。

7.根据权利要求6所述的一种基于纳米纤维空间结构可控的仿生组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述扩增是将活化得到的菌液与发酵培养液按1:10~1000的体积比混合后进行静置培养；

静置培养的温度为28~37℃，时间为3~9天。