[发明专利]一种工程化神经细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种工程化诱导多能干细胞，其特征在于，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞；

所述质粒包括pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA。

2.根据权利要求1所述的工程化诱导多能干细胞，其特征在于，所述诱导多能干细胞包括人源诱导多能干细胞。

3.一种工程化神经细胞，其特征在于，所述工程化神经细胞来源于权利要求1或2所述的工程化诱导多能干细胞；

优选地，所述工程化神经细胞为将权利要求1或2所述的工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养得到。

4.一种具有阿尔兹海默症表型的细胞，其特征在于，所述具有阿尔兹海默症表型的细胞来源于权利要求1或2所述的工程化诱导多能干细胞或权利要求3所述的工程化神经细胞；

优选地，所述具有阿尔兹海默症表型的细胞为将权利要求3所述的工程化神经细胞进行定向分化培养得到。

5.一种权利要求4所述的具有阿尔兹海默症表型的细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞，培养获得工程化诱导多能干细胞；

(2)将所述工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养，得到预分化状态的工程化神经细胞；将所述预分化状态的工程化神经细胞在含有神经生长因子的环境中连续培养后，得到分化成熟的工程化神经细胞；

(3)采用β-淀粉样蛋白处理所述分化成熟的工程化神经细胞，获得所述具有阿尔兹海默症表型的细胞。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述导入包括：

将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA质粒分别包装为慢病毒，利用慢病毒系统将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述工程化诱导多能干细胞的冻存液为CryoStor CS10细胞冻存液。

8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导采用的抗生素为多西霉素；

优选地，步骤(2)所述筛选采用的抗生素为嘌呤霉素；

优选地，步骤(2)所述分化培养采用的培养基包括第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基；

优选地，所述第一培养基为含有1～3μg/mL多西霉素的KSR培养基；

优选地，所述第二培养基为含有1～3μg/mL多西霉素和0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素的KSR+N2B培养基；

优选地，所述第三培养基为含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素和B27的N2B培养基；

优选地，所述第四培养基为含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素、5～15ng/mL脑源性神经营养因子、5～15ng/mL睫状神经营养因子、5～15ng/mL胶质细胞源性神经营养因子和B27的NBM培养基。

9.根据权利要求5-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述处理的时间为48～96h。

10.根据权利要求5-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)使用含有8～12μM Rock抑制剂的mTeSR1培养基培养人源诱导多能干细胞36～60h；

(2)将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA质粒分别包装为慢病毒，使用含有所述慢病毒的mTeSR1培养基培养人源诱导多能干细胞4～8h，补充mTeSR1培养基培养，获得工程化人源诱导多能干细胞；

(3)使用含有8～12μM Rock抑制剂的mTeSR1培养基培养所述工程化诱导多能干细胞至细胞密度达40％～50％，将培养基替换为含有1～3μg/mL多西霉素的KSR培养基继续培养20～24h，将培养基替换为含有1～3μg/mL多西霉素和0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素的KSR+N2B培养基继续培养20～24h，将培养基替换为含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素和B27的N2B培养基继续培养20～24h，获得预分化状态的工程化人源神经细胞；使用含有1～3μg/mL多西霉素、0.3～0.7μg/mL嘌呤霉素、5～15ng/mL脑源性神经营养因子、5～15ng/mL睫状神经营养因子、5～15ng/mL胶质细胞源性神经营养因子和B27的NBM培养基培养上述预分化状态的工程化人源神经细胞18～24天，获得分化成熟的工程化人源神经细胞；

(4)使用含有β-淀粉样蛋白的mTeSR1培养基培养所述工程化神经细胞48～96h，获得人源具有阿尔兹海默症表型的细胞。