[发明专利]一种基于DNA稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法

权利要求书

1.一种基于DNA稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)基于颗粒污泥的短程反硝化系统的启动以及三氯生在该系统中的生物去除，以丙酸钠为碳源，硝酸钠为氮源，接种好氧颗粒污泥，启动短程反硝化系统，成功启动后向系统内投加三氯生，探究三氯生在该系统中的生物降解；

(2)在步骤(1)反应运行末期，分别取泥进行¹³C-丙酸钠、¹³C-三氯生同位素微宇宙实验，分别采集短程反硝化系统中的污泥样本分别对应加入¹³C-丙酸钠、¹³C-三氯生、¹²C-丙酸钠、¹²C-三氯生进行同位素微宇宙实验，分别孵育，然后提取污泥DNA；

(3)采用基于氯化铯密度梯度溶液的超高速离心方法分离重层DNA，分别向步骤(2)提取的DNA样品中加入氯化铯和GB缓冲溶液，进行超高速密度离心，离心后的样品进一步进行分层纯化得到不同密度层级的DNA溶液；

(4)进行DNA标记程度评价及菌群结构分析，分别对步骤(3)中¹²C/¹³C-丙酸钠标记的分层纯化后的DNA样品进行narG和nirS基因qPCR定量，通过比较¹²C/¹³C各层样品narG和nirS基因的相对丰度，反映¹³C-丙酸钠标记的重层DNA在浮力密度梯度中的分布状况，从而评价标记上的重层微生物为短程反硝化菌还是条件短程反硝化菌，再针对被¹³C-丙酸钠标记且筛选出的重浮力密度DNA以及对应重浮力密度的¹²C-丙酸钠DNA样品进行16S rRNA V3-V4区高通量测序；对¹²C/¹³C-三氯生标记的DNA样品，选择分层纯化后的3-5重层DNA样品直接进行16S rRNA V3-V4区高通量测序；最终对比¹²C和¹³C重层DNA样品的微生物群落结构，从而同时鉴定短程反硝化系统中的活性反硝化菌和三氯生降解菌。

2.根据权利要求1所述的一种基于DNA稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，其特征在于，步骤(1)的进水碳氮比为3，进水丙酸钠、硝态氮和三氯生浓度分别为315mg/L、105mg/L和3mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种基于DNA稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，其特征在于，步骤(2)所述的污泥样本为加入3mg/L三氯生的短程反硝化系统中具有稳定的三氯生降解能力的颗粒污泥样本。

4.根据权利要求1所述的一种基于DNA稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，其特征在于，步骤(2)所述的¹³C-丙酸钠、¹²C-丙酸钠的浓度均为105mg/L，¹³C-三氯生、¹²C-三氯生的浓度均为1mg/L，污泥浓度为2000mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种基于DNA稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，其特征在于，步骤(2)中添加¹²C-丙酸钠和¹²C-三氯生的处理分别作为对照组，添加¹³C-丙酸钠和¹³C-三氯生的处理分别作为实验组。

6.根据权利要求1所述的一种基于DNA稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，其特征在于，步骤(2)所述的分别孵育，具体为¹³C-丙酸钠的同位素微宇宙实验时间为8个周期，每个周期反应4h，¹³C-三氯生同位素微宇宙实验时间为1个周期，1个周期时间为3天。