[发明专利]一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其应用

说明书

本发明公开了一株产生番茄红素的重组乳酸乳球菌菌株及其构建方法和应用。所述的重组菌株是通过消除番茄红素合成前体物的2条竞争途径：乳酸脱氢酶基因和α‑乙酰乳酸合成酶基因的部分核苷酸序列；再使用质粒引入菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因(crtE)、八氢番茄红素合成酶基因(crtB)和八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)构建得到。实验证实本发明的重组乳酸乳球菌经过摇动培养后能够产生番茄红素，也预示该重组乳酸乳球菌在保健品和生物药物开发领域具有广阔的应用潜力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌及其构建方法和应用。

背景技术

几个世纪以来，乳酸乳球菌一直应用于奶酪、酸奶、酸菜等食品的发酵，是美国食品药品监督管理局认定的安全级微生物。乳酸乳球菌也有一些益生特性，如具有免疫调节特性、通过胃肠道(GIT)存活性，但又不在肠道内定植等，这些特性使乳酸乳球菌成为生物治疗药物的优选传递体。2000年，Science杂志报道了使用重组乳酸乳球菌分泌白介素10以治疗小鼠的结肠炎，随后20年内，以乳酸乳球菌做载体用于近60种治疗药物的传递，所针对的病症涵盖肠炎、流感、糖尿病、感染、乃至癌症。当下随着生物技术的迅猛发展，通过理性设计对乳酸乳球菌进行遗传改造，获得功能强化的菌株，实现对疾病的诊断或治疗，符合精准医疗的发展趋势。

番茄红素是异戊二烯类化合物，属于类胡萝卜素，分子式是C₄₀H₅₆，分子量为536.89，由8个异戊二烯单元构成的包括11个共轭双键和2个非共轭双键的脂溶性碳氢化合物。由于番茄红素中存在多个共轭双键而具有极强的抗氧化能力，是自然界最强的抗氧化剂之一，具有抗辐射、防癌抗癌、防治心血管疾病等多种生理功能。因此番茄红素被广泛应用于药品、保健食品中。中国居民膳食营养素参考摄入量(2013版)建议番茄红素应为18-70mg/天。

由于哺乳动物体内无法合成番茄红素，机体所需的番茄红素必须从外源摄取。目前番茄红素制备方式有植物提取、化学合成和微生物发酵。植物提取法获得的番茄红素无污染，但成本过高。化学合成法原料价格低廉、反应速率快、产量高，成本较低，但是终产物难以控制、与天然番茄红素结构差别大、生物活性低，且有化学试剂残留，因此使用范围受到限制。发酵法生产是利用微生物转化葡萄糖等价格低廉的碳源产生番茄红素，再从菌体中提取出来。微生物发酵法具有生产周期短、不受气候、地理位置因素影响，且发酵过程易控制，产品安全性高等优点。很多光合细菌和部分革兰氏阴性非光合细菌均能合成番茄红素，例如固氮红细菌、噬夏孢欧文氏菌和草生欧文氏菌等，但是由于产物含量较低，只用作类胡萝卜素合成机理研究模型。近年代谢工程与合成生物学的发展快速推动了微生物细胞工厂的应用，以大肠杆菌、酵母菌和三孢布拉氏霉菌等作为细胞工厂实现了番茄红素高产量合成。

乳酸乳球菌是食品安全技术微生物，是生物治疗药物传递的优选宿主，同时在乳酸乳球菌细胞合成番茄红素可以强化菌株的抗氧化能力，且重组乳酸菌具有抗癌防癌等生理功能，产物合成后无需提取可直接以活菌药物的形式服用，在产品的使用方式或活性保存方面优势巨大。经检索，通过遗传改造乳球乳球菌消除其番茄红素合成前体物的2条竞争途径：乳酸脱氢酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因的部分核苷酸序列；再使用质粒引入菠萝泛菌来源的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因(crtE)、八氢番茄红素合成酶基因(crtB)和八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)构建能够产生番茄红素的工程菌株重组乳酸乳球菌及其应用还未见报道。

发明内容

针对现有乳酸乳球菌无法合成番茄红素的不足，本发明提供了一种产生番茄红素的重组乳酸乳球菌，同时提供了重组菌株的构建方法和应用。

本发明所述的产生番茄红素的重组乳酸乳球菌，是通过在乳酸乳球菌中消除其番茄红素合成前体物的两条竞争途径：乳酸脱氢酶途径和α-乙酰乳酸合成酶途径；再对该菌株中引入外源表达元件后构建获得；

其特征在于：